サブの光トラップ

Sep 14, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8615 (2023) この記事を引用

394 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

光ピンセット (OT) は主に小さなサイズの粒子を閉じ込めるのに使用されますが、対向伝播 (CP) デュアルビームトラップは、生体試料を含む小さなサイズと大きなサイズの粒子の両方を閉じ込める多用途の方法です。ただし、CP トラップは複雑で敏感なシステムであり、OT と比較してかなり低いトラップ剛性値で完全な対称性を達成するには、面倒な調整が必要です。さらに、CP トラップは力が比較的弱いため、閉じ込めることができる粒子のサイズは約 100 μm に制限されます。この論文では、対称性が崩れた新しい種類の逆伝播光ピンセットが議論され、液体媒体内の 100 μm を超える粒子を捕捉して操作できることが実験的に実証されています。私たちの技術は、非対称的な方法で折り返される単一のガウスビームを利用して、光学力のみに基づいて小さな粒子と非常に大きな粒子（直径250μmまで）を閉じ込めることができるCPトラップを形成します。私たちの知る限り、このような大型試料の光トラッピングはこれまで実証されたことがありません。トラップの対称性の崩れとビームの再帰反射の組み合わせにより、システムのアライメントが大幅に簡素化されただけでなく、後で示すように、わずかな位置ずれに対して堅牢になり、トラップの剛性も向上しました。さらに、私たちが提案する捕捉方法は、非常に低いレーザー出力と開口数の光学系を使用して、微生物を含む1ミクロンから数百ミクロンまでの範囲のさまざまな粒子サイズと形状の捕捉と変換を可能にするため、非常に多用途です。これにより、光学的に捕捉された標本を画像化して研究するための幅広い分光技術の統合が可能になります。例として、この新しい技術がどのようにして最大 450 μm の長さの C. elegans 線虫の 3D トラッピングとライトシート顕微鏡観察を同時に可能にするかを示します。

レーザーは、強力な光学力、粒子の操作、および捕捉につながる独特の光と物質の相互作用を可能にします1、2、3、4、5、6、7、8。光トラッピングは、多くの応用が可能な多用途ツールであり、その発見以来、豊富な基礎研究を可能にし、科学および工学の多くの分野に革命をもたらしてきました9、10、11、12、13、14、15。光トラップの最も基本的かつ強力な実装は、光ピンセットとして知られるシングルビーム勾配力トラップです16、17、18。この方法では、レーザービームが十分に強く集束され、対象の粒子にかかる光学力によって粒子が閉じ込められると、トラップが形成されます。これらの力は一般に 2 つの主要な寄与に分類されます。 1 つは、背景媒体に対して屈折率の高い粒子をレーザー強度のより大きな領域に引き込む勾配力です。 2 つ目は、主に粒子をビーム伝播方向に沿って押す散乱力です。後者の力は粒子の捕捉を妨げる可能性があり、特に大きな粒子 (10 μm 以上) の場合、捕捉が不安定になります。したがって、散乱力の悪影響を補償する実用的なアプローチを見つけることは、安定した光トラップにとって重要なステップです。一般的な解決策の 1 つは、高 NA (開口数) の顕微鏡対物レンズを使用してビームをしっかりと集束させ、軸方向の散乱力を上回る点まで勾配力を増加させることです。このような焦点合わせには通常、開口数が 1 を超える顕微鏡対物レンズ (したがって液浸タイプ) が必要です。その結果、作動距離が短くなり、視野が狭くなり、極度の局所強度が生じ、通常、特に生物学における実際の用途のニーズと矛盾します。前述の欠点を回避できる別のアプローチは、2 つの適度に集束された逆伝播 (CP) 同一ビーム 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 を使用することです。ここでは、各ビームが他方の前方散乱力のバランスを取り、軸方向の安定性を生成して 2 つのビームの焦点間に 3D トラップを形成します。このようなサスペンション内部の光トラップは、高 NA 対物レンズ 25,26、低 NA 対物レンズ 19,31、2 本のファイバー 20,32,33,34、光学ミラートラップ 35,36,37,38,39,40,41、光位相を使用して実現されています。共役42、ホログラフィック逆伝播トラップ23、37、40、およびナノ粒子をトラップするのに理想的な定在波21、22、23、24、35、36、37、38、39。これらのCPトラップ構成では、数十ミクロン離れた焦点間でトラップが発生するため、光損傷が軽減されるだけでなく、最大100μmまでのより大きな粒子の閉じ込め（マクロトラップとして知られる）も可能になりました36、37、41。。

ただし、トラップは 2 つの焦点の間でビーム焦点からわずかに離れた位置に形成されるため (OT とは異なり)、勾配力、したがってこれらの CP ビームトラップ法のほとんどの剛性値は非常に小さくなります 31,36,40。その結果、特にマクロトラップの場合、オブジェクトの横方向の動きや回転が遅くなる可能性があります41。さらに、CP ビームトラップの対称性要件により、トラップ剛性は完全な位置合わせに対して非常に敏感です。その結果、デュアル CP ビーム法の調整が困難になる可能性があるだけでなく、粒子の正確な位置決めや力の測定も CP トラップ構成に限定されます。粒子操作範囲を拡張するために焦点距離を長くすると、この問題はさらに悪化します。これは、CP トラップの場合、光学力、したがってトラップの安定性が焦点の分離に強く依存するという事実によるものです 31,36,43。ここで生じる疑問は次のとおりです。デュアル CP ビーム構成を変更してアライメントの複雑さを簡素化し、その結果トラッピング剛性の感度を下げて完全な対称にすることができるでしょうか? また、100μmを超える粒子を安定して閉じ込めるために、捕捉サイズの限界を増やす方法はあるのでしょうか?

以前の研究では、光トラップを形成するために低 NA コンポーネントの使用とともにデュアル非対称逆伝播 (ACP) ビームを利用することで、最初の疑問に対処しました。我々は、2 CP ビームシステムに導入された非対称性により、(従来の CP ビームトラップと比較して) トラップ剛性が向上するだけでなく、広い空間長にわたって軸方向の散乱力のバランスがとれることを示しました。これにより、ミリメートル範囲にわたって安定したトラッピングと粒子操作が可能になり、トラッピング剛性は焦点分離にほとんど依存しませんでした。

この論文では、より大きな粒子の捕捉に関する 2 番目の質問に対処する予定ですが、その前に、以前に提示したものより大幅に複雑でない ACP トラップを作成するためのセットアップについて説明します 44。このシステムの位置合わせが非常に簡単で、位置ずれに対する感度が大幅に低い理由を説明します。次に、提案されたシステムの捕捉特性が研究され、液体媒体内で長距離の粒子を簡単に操作できることが示されます。我々の調査結果は、同様の実験条件を使用した場合、従来の対称デュアル CP トラップと比較してトラップ剛性値が向上していることを示しています。その後、光学力のみを使用して、非常に大きな物体、特に異なる長さ（最大 450 μm）の線虫などの細長い生体サンプルを捕捉する際の、提案された ACP ビームシステムの応用を観察します。最後に、ライトシート蛍光顕微鏡などの分光イメージング技術をこの安定したトラッピングシステムに簡単に統合して、標本を移動させることなくより詳細な画像を生成する方法を示します。

ACP デュアルビームトラッピングシステム 44 では、従来の対称 CP ビーム設定とは異なり、非常に異なる焦点距離を持つ 2 つの異なる光学系を利用してトラップを作成します。この目的のために、15 cm の長い焦点距離 (したがって長いレイリー範囲) を持つレンズがサンプルの片側に配置され、低 NA 対物レンズ (粒子サイズに応じて 0.25 ～ 0.4) がもう一方の側に配置されます。。したがって、一方の側が比較的狭い焦点（OT のような）を作成する一方で、もう一方の側はサンプルチャンバー内にほぼ平行なビームを生成し、反対方向に伝播します。このようなシステムでは、対物レンズが 2D 閉じ込め (横方向) を可能にしながら、2 つの ACP ビームが連携して散乱力 (軸方向) のバランスを取り、安定した 3D トラップを作成します。 2 つのビームのうちの 1 つはサンプル内でコリメートされて動作するため、逆方向に伝播するビームのより厳密な焦点が移動すると、後で示すように、トラップは数百ミクロンにわたって目立った安定性の変化なしにシフトします。低 NA の対物レンズが使用されているため、熱の影響が回避されることに注意してください。

この研究では、ACP トラップを生成するために、以下で説明する図 1a に見られるように、1 つの入射レーザービームのみを使用する以前の研究 44 と比較して、より単純化されたシステムを使用します。左側からシステムに入射するレーザービームはレンズ (fl = 15 cm) によって集束され、長いレイリー範囲 (zr ≈ 650 µm) の最初の焦点を形成します。次に、このビームは低 NA の顕微鏡対物レンズによって収集され、エンドミラー (M) に導かれ、途中で可変減光フィルターホイール (VND) を 2 回通過しながら、ミラー自身に折り返され、パワー調整が可能になります。再帰反射されたビームは、同じ顕微鏡対物レンズの後部開口部にまっすぐ進み、最初の焦点の zr 以内のどこかでよりきつい焦点 (2 番目の焦点) に達し、反対方向に伝播して ACP ビームトラップを形成します。各ビームだけでは粒子を捕捉することはできず、むしろ粒子を押しのけます。 2 つのビームの相乗効果によってのみ、対物レンズの位置によって制御され、zr 内外の任意の点で発生する可能性のある緊密な 3D トラップを生成できます。図 1b は、ACP ビームによって生成される潜在的な景観を示しています。図 1b を得るために、すべての入射ビームによる放射圧力を \({\mathrm{S}}_{\mathrm{z}}/\mathrm{c}\) として計算しました。ここで、\({\mathrm{S }}_{\mathrm{z}}\) は軸方向の合計ポインティングベクトル、\(\mathrm{c}\) は光の速度です。図1bの潜在的な地形を取得するために、任意の基準点から対象の位置までの \(\mathrm{z}\) 方向の放射圧の経路積分を実行しました。その結果、その勾配が光軸上の各点での放射圧力を生み出すポテンシャルが得られます。図 1c は、正面と側面の両方のイメージングを含む ACP トラップを作成するために私たちの研究室で使用したセットアップを示しています。ここで、正面視イメージングを行うために、図 1a のミラーをノッチフィルター (NF) に置き換えます。NF は、トラップを形成するレーザービームに対してミラーのように機能し、他のすべての波長を透過します。対物レンズ (MO1) は、正面からのイメージングと、光トラップのためのより厳密な焦点の生成の両方を担当します。このため、電動ステージ上に設置されているため、焦点の正確な位置は私たちが制御できます。また、1/4 波長板 (\(\lambda /4\)) がシステム内に配置され、再帰反射ビームの偏光が変化し、定在波の形成が防止されます。従来のデュアル CP トラップと比較して、当社のセットアップは大幅に複雑さが軽減され、位置合わせが容易で、後で示すように全体的に軸方向のトラップ剛性が大きくなっているため、わずかな位置ずれに対してより堅牢です。これらは主に、単一の再帰反射ビームの使用、低 NA 光学系、およびトラップを形成するビームの中心付近での対称性の破れによるものです。

1 つの入射ビームによる逆反射 ACP トラップのセットアップ: (a) ACP トラップ形成の基本的な考え方: 左側からセットアップに入る唯一の入射ビームは、レンズを通過してコリメートされた長いレイリー範囲で緩い焦点を作成します。低 NA の顕微鏡対物レンズによって、エンドミラー (M) によって折り返されます。 VND は可変減光度フィルターホイールです。 (b) は、対物レンズの焦点がレンズの焦点から 500 μm 離れている場合の、非対称トラップのポテンシャル井戸の形成を示す ACP システムのシミュレーションです。 (c) 実験で使用した再帰反射 ACP セットアップ: 830 nm レーザー (MSquared Equinox SolsTiS PI)、L1 および L2: f1,2 = 15 cm の 2 つのレンズ、L1 と MO1 の組み合わせ (Olympus 20x/0.40 またはオリンパス 10x/0.25（粒子サイズに応じて）は、単一の再帰反射 ACP ビームに基づいて 3D トラップを作成します。必要に応じて、MO1 を使用すると正面の観察と追跡が可能になり、L2 は正面のイメージングに使用されます。 MO2: 4x (オリンパス 4x/0.1) ～ 20x (オリンパス 20x/0.40) の対物レンズをサイドビューに使用します。 MO1 は軸方向に移動する電動ステージ (MS) に取り付けられています。 BE ビームエキスパンダー、WL 白色光、830 nm ビームを反射する NF 830 nm ノッチフィルター、DM ダイクロイックミラー、S: サンプル、ビームの偏光を 90° 変える 4 分の 1 波長板 (\(\lambda /4\))そこを2回通過します。 2台のカメラはCMOSカメラです。

再帰反射 CP ビームを使用して、定在波の生成によるナノ粒子 21,24,35,36,37,38,39 または 2 つの密集焦点間のマイクロ粒子 36,40,41,43 のいずれかを捕捉して操作する研究が数多くあります。ミクロン離れています。ただし、それらは、病巣の分離に大きく依存するトラップの剛性の値が比較的低いことを示しています 31,36,43。これにより、操作範囲が最大でも数十ミクロンに制限され、剛性値が低いため粒子の移動や回転が生じ、より長い走査時間を必要とする特定の顕微鏡技術では画質が低下する可能性があります。すぐにわかるように、ここで提案されている ACP トラップシステムは、トラップの剛性を高めるだけでなく、その値を焦点距離にほぼ依存せずに維持するため、より大きな粒子や微生物を移動することなくトラップ、送達、またはイメージングすることができます。

一般に従来の CP トラップシステムでは、(OT に対して) より低い NA 光学系が使用されるため、特に完全な対称性により焦点の間にトラップが形成されるため、勾配力は小さくなります。操作範囲を広げるために焦点の間隔が数十ミクロンに増加すると、これらの力はさらに弱くなります 31,36,43。この場合、軸方向のトラップは単に散乱力のバランスによるものです。ただし、ACP トラップの場合、ビームの対称性が崩れているため、トラップが焦点間のどこかではなく、焦点の位置に形成されるように出力比を慎重に調整することで、剛性値を大幅に改善できます。より厳密な焦点。この場合、軸方向の散乱力は依然としてバランスが保たれていますが、よりきつい焦点に近いため、粒子が感じる横方向の勾配力ははるかに強くなります。これは、一方のビームがほぼ平行（数百ミクロン）であるのに対し、もう一方のビームはより厳密に焦点が絞られ、急速に発散するため、焦点から離れると放射圧力が低下します。したがって、パワー比を調整することで、より緊密な焦点の位置で軸方向のバランスを作り出すことができ、この焦点が（対物レンズを動かすことによって）平行移動されると、図2aに概略的に示されているように、トラップの位置も変化します。ここで、ACPビームによって生成されるポテンシャル井戸の軸方向の位置（トラップ位置）は、図1bに示すように、より緊密な焦点の位置によって完全に支配されます。この図では、レンズの焦点は位置 0 にあり、対物レンズの焦点は 500 μm 離れており、プロットに示されているように、生成されたポテンシャル井戸の位置は対物レンズの焦点と一致します。

粒子の移動動作: (a) 移動対物レンズ MO1 によるトラップ位置の移動の概略図。（b、c）MO1が自由空間（水中で100μmを指す）で100/1.33μmステップで移動するときの、ACPビームに沿った水中でのトラップされた5μm粒子（ポリスチレンビーズ）の移動の実験結果。 (b) 閉じ込められた 5 μm 粒子の懸濁液内のトラップ位置の関数としての軸方向および横方向のトラップ剛性の測定。 (c) 空気中での軸方向の目的の移動と懸濁液内の軸方向の粒子の位置との間に見出された実験的関係。

L1がfl = 15 cm、MO1がNA = 0.4の20倍対物レンズである図1cに示すセットアップを利用して、水で満たされた幅1 mmの石英キュベット内に5 μmのポリスチレンビーズを閉じ込めるACPトラップを生成しました。使用されるレーザー出力は、レンズ (L1) と対物レンズ (MO1) からそれぞれ 50 mW と 25 mW です。より低い電力を使用することもできますが、トラップの剛性が低下します。粒子がトラップ（MO1 の焦点の位置と一致した）に落ちると、MO1 を動かすことで粒子を ACP ビームに沿って前後に並進させることができます。対物レンズの軸方向の移動による捕捉粒子の変位挙動と、長さ1 mmのさまざまな位置でのトラップの剛性値の実験的測定を図2b、cに示します。プロット (b) では、レンズの焦点はキュベットの左側の壁の位置に固定され、対物レンズはこの壁に対してサンプルチャンバーの外側で右側に向かって 100 μm/nwater ずつ移動しました。 n水 = 1.33。増分値は、水中での MO1 の焦点の 100 μm の変位に対応します。図2cに示すように、捕捉された粒子は、サンプル内部の500μmの位置まで、ほぼ1対1の比率でMO1の変位に従います。その後、逸れ始め、粒子の移動がわずかに減少し、線が曲がり始めます。このずれは、粒子がレンズの焦点から遠ざかるにつれて、適度に集束されたビーム (レンズ L1 による) によって粒子に加えられる散乱力 (軸方向放射圧力) がより顕著に低下し始めるために発生します。結果として、これにより、軸方向の力がバランスするより緊密な焦点からわずかに離れた位置にトラップが形成されることになります。

また、軸方向と横方向の剛性 (κz、κx) を測定することにより、サンプルチャンバー内の粒子位置の関数として ACP トラップの安定性を特徴付けました。図 2b は、長さ 1 mm までの懸濁液内での粒子の軸方向の移動が 100 µm ごとに行われた後のトラップの剛性測定の結果を示しています。これらの測定では、PSD（パワースペクトル密度）法を使用し、各位置で軸方向と横方向の両方で測定を10回繰り返し、平均してそれぞれκzとκxを求めました。 PSD は、1000 fps のサイドビュー CMOS カメラを使用して粒子を 10 秒間追跡することによって検出されます。最初と最後のデータポイントは、表面効果を避けるために壁から 25 μm 離れた場所で測定されます。図 2b で観察されるように、トラップ位置を最大 500 μm まで移動しても、軸方向と横方向の剛性値は両方ともほぼ一定のままです。この範囲では、平均測定剛性値は κx = 7.7 pN/μm および κz = 3.8 pN/μm であり、これは以前に報告された従来の CP トラップ剛性よりも約 1 桁大きいです 6,36,40,41。使用済み。ここで示す剛性値の上昇の理由は、システムの非対称性によるものです。これにより、トラップが対物レンズの焦点の非常に近くに形成され、その結果、粒子が感じる勾配力が強化され、焦点の分離とは独立しています。～500μm。従来の CP トラップの場合、完全な対称性により、トラップは焦点の中央に形成され、その距離に応じて、粒子にかかる勾配力、したがって剛性値が大幅に小さくなる可能性があります。粒子をレンズのレイリー範囲の外にさらに移動させると、粒子は閉じ込められたままになりましたが、測定されたトラップの剛性は低下しました。この結果は、プロット 2c で観察された線の曲がりと一致しており、粒子がレンズのレイリー範囲からさらに遠ざかるにつれて、トラップの位置が対物レンズの焦点から外れることが原因です。この偏差により、粒子が感じる勾配トラップ力が減少し、剛性値の減少につながります。

まったく同じ設定を使用して、水性懸濁液内で直径 1 ～ 100 μm のポリスチレン粒子を捕捉し、移動させることができました。このシステムの機能と図 2 に示した結果は、粒子の捕捉と操作における ACP システムの柔軟性を示しています。数百ミクロンにわたるミクロン精度でトラップの軸方向の位置を移動および制御できる機能は、非常にユニークです。これらの特性は、トラップされた粒子がトラップから脱出する前に数十ミクロンしか移動できない従来の CP トラップとは大きく異なります。また、対称 CP トラップの場合、1 つの対物レンズの焦点がサンプル内で距離 d だけ移動すると、トラップされた粒子は d/2 だけ移動します。これらすべての違いは、ここで紹介した非対称性から生じます。

再帰反射ACPトラップの特性と従来のCPトラップとの違いをさらに調査するために、実験で使用したものと同様のパラメータを使用して両方のシステムの軸力を理論的にモデル化しました。この研究の結果についてはここで簡単に説明し、補足図S1で詳細を確認できます。私たちの計算によると、ACP トラップでは、焦点の間隔が大きくても (500 μm 以上)、既存の強い光学力により粒子が閉じ込められることがわかります。この結果は、図 2 に示した実験結果と一致しており、捕捉された粒子を数百ミクロンにわたって簡単に移動できる理由を説明しています。一方、対称 CP トラップに関する理論的発見は、ACP トラップの理論的発見とは対照的です (横方向剛性値は同等)。対称 CP トラップの場合、焦点の間隔が数十ミクロンより大きくなると、軸方向の力が小さくなりすぎ、安定した 3D トラップが不可能になります。この結果は、従来の CP トラップに関する以前の報告と一致しており、トラップ剛性は焦点分離の強い関数であり 36,43、焦点分離が増加するにつれて急速に低下します。これにより、CP トラップの操作領域が数十ミクロンに制限されます。別の理論的研究では、ACP と CP トラップの両方の電力比のみを変更することによって両方の変換能力を調査しました。補足図S1aに示す結果は、どちらの場合でも電力比を変更しても、トラップの位置は数十ミクロンだけ移動することを示しています。全体として、軸力の研究から得られた我々の発見は、従来の CP トラップシステムに導入された非対称性がどのようにして光学力の範囲を大幅に拡張し、その結果、ミリメートルパス内の正確なトラップ位置の制御を向上させることができるかを示唆しています。

これまでのところ、提案されている再帰反射 ACP トラップを使用して小さな粒子の閉じ込めを実証しただけです。ただし、すぐに観察するように、この技術は、球形または非球形の非常に大きなマクロサイズの粒子を捕捉するのに非常に適しています。このセクションでは、大きなポリスチレンビーズの 3D トラッピングから始めて、生きた生体サンプルの閉じ込めを実証します。まず、図1cのセットアップを使用して（MO1、2はNA 0.25の10倍対物レンズです）、図3aに示すように、水性懸濁液内に150μmのポリスチレンビーズをトラップすることができました。この閉じ込めのビデオは補足視覚化 1 にあります。図 3a に示すように、比較の目的で懸濁液に 10 μm のポリスチレンビーズを追加しました。また、MO1 をゆっくりと動かすことで 150 µm の粒子を並進させることもできました。このビーズの並進を示す一連の画像は、補足視覚化 2 に示されています。このような大きなポリマービーズを捕捉するために使用されたレーザー出力は、合計 100 mW でした。レンズ L1 を出るビームから 67 mW、レンズ L1 を出る再帰反射ビームから 33 mW でした。 MO1とサンプルを入力します。以前の研究 48 では、100 μm のポリマー球が各ファイバーアームから 800 mW の捕捉力で 2 本のファイバー間に捕捉されたことに注意することが重要です。その研究と比較して、私たちの研究で使用された出力レベルは大幅に小さく、ここで捕捉される粒子は 1.5 倍大きくなります。捕捉に必要な電力は比較的小さく、さらに大きな物体を閉じ込めることができることから、ACP ビームトラップは生物学的標本を捕捉するための理想的なツールであることがわかります。

再帰反射 ACP トラッピングシステムを使用した、はるかに大きなミクロンサイズのオブジェクトのトラッピング。 (a) 150 μm のポリスチレンビーズ、(b) 115 μm の Volvox、および (c) 250 μm の Micrasterias Waris 生きた微生物の閉じ込め。

次に、同じ設定とパラメータを使用して、115 μm の Volvox (図 3b) と 250 μm の Micrasterias Waris (図 3c) の生きた微生物を水中に容易に捕捉することができました。閉じ込められたミクラステリアスワリスのビデオは、補足視覚化 3 で入手できます。

染色体、細胞内小器官、さまざまな細菌や寄生虫、膜細管、特定の微細藻類や微小虫など、多くの生物学的サンプルは細長い形状または棒状です。このようなサンプルを光トラップするには、通常、ビーム整形を含む複雑なシステムが必要です。したがって、特定の配向で棒状粒子を 3D 光学的に捕捉することは困難であるか、不可能である可能性があります。ここで、図 4 に示すように、2 番目のレーザービームを再帰反射 ACP トラップシステムに組み込むことにより、以下で説明するように細長い物体や棒状の物体を簡単にトラップすることができます。わずかに異なる波長 (約 30 mW で λ = 785 nm) で選択された 2 番目のビームは、DM (ダイクロイックミラー) を使用して再帰反射された 830 nm ビームと結合され、両方とも共伝播中に MO1 に入ります。 2つのビームはサンプル（図4aのB2とB3）を通過し、2つの別々の位置に焦点を合わせます。その距離は、レンズL3を移動することによって簡単に制御できます（fl = 15 cmで、785 nmレーザービームの発散が変化します）。 3 つのビーム (B1、B2、B3 はそれぞれ約 80 mW、約 30 mW、約 30 mW) の組み合わせにより、細長い物体用の 3D トラップが形成されます。このシステムを使用して、ゾウリムシアウレリア (図 4c) および線虫 Caenorhabditis elegans (C. elegans) 微生物 (図 4d、e) を捕捉することに成功しました。閉じ込められた線虫は、長さ 250 ～ 450 μm のさまざまなサイズのさまざまな幼虫段階にありました。デュアル ACP トラップに閉じ込められた幼虫 (ステージ L2) の媒体は、補足視覚化 4 で見つけることができます。

(a) 3 つのビームの組み合わせを使用して細長い物体を閉じ込めるために提案されているデュアルトラップ ACP ビームの概略図。 B1 は長いレイリー範囲で L1 (fl = 15 cm) で集束された 830 nm ビーム、B2 は MO1 (オリンパス 10x/0.25) でしっかりと集束された再帰反射ビームです。 B3 は 785 nm のレーザービームで、これも B2 の焦点の少し後に MO1 によって焦点を合わせられます。 (b) 細長い物体の 3D 閉じ込めを実現するために、折りたたみ ACP ビームのセットアップを変更しました。ここで、MO1 は NA 0.25 の 10 倍で、MO2 はオブジェクトのサイズと用途に応じて 4 倍、10 倍、20 倍の対物レンズの間で変化します。 (c – e) は、光学的に捕捉された微生物の明視野画像です: (c) 130 μm ゾウリムシアウレリア、(d) 260 μm、(e) 385 μm C. elegans 幼虫。

次に、図4bに示すACP捕捉システムにライトシート蛍光顕微鏡を追加し、捕捉されたC.エレガンス幼虫の3D捕捉と画像化を同時に行いました。この顕微鏡検査では、幼虫の脂肪滴を蛍光染料ナイルレッド (脂質環境で蛍光を発する親油性染料) で染色しました。図5aに示すように、532 nmレーザーを使用して、閉じ込められた染色された線虫を励起します。ビームはシリンドリカルレンズ (CL、fl = 7.5 cm) によってステアリングミラー (SM) 上に集束され、リレーレンズの組み合わせ (2 つの同一のレンズ) によって MO3 対物レンズ (10 倍、NA 0.3) の後部開口部に中継されます。 L2 と L3 (fl = 5 cm)。蛍光は、NA 0.6 の 20 倍の水浸顕微鏡対物レンズ (MO2) を使用して照明面に垂直に収集され、トップビュー CMOS カメラで画像化されます。 450 μmの染色されたC.エレガンス幼虫の明視野画像を図5bに示します。幼虫が横たわっている面に平行に撮影された断面ライトシート画像の例を図5cに示します。

(a) 光学セットアップの拡大図。光トラッピング (L1 および MO1) およびライトシート蛍光顕微鏡 (MO2、MO3、L2 ～ L4) に関与する対物レンズとレンズのみを示しています。ここで: fl = 7.5 cmのCLシリンドリカルレンズ、MO3はNAが0.3の10倍対物レンズ(オリンパスUPlanFL N 10×/0.30)、MO2はNAが0.6の20倍水浸対物レンズ(Thorlabs TL20X-MPL 20×/) 0.60 W/400 ～ 900 nm \(\infty\)/WD 5.5 mm)。 L2 と L3 はどちらも fl = 5 cm のリレーレンズシステムです。 fl = 10 cmのL4がイメージングに使用されます。 (b) は 450 μm で染色した C. elegans 幼虫の明視野顕微鏡写真、(c) は (b) に示した同じ幼虫のライトシート蛍光顕微鏡画像です。

ここで、より小さな捕捉物体（≤ 100 µm）の場合、MO1 はトラッピングとライトシート形成の両方に使用できるため、ライトシート顕微鏡検査に MO3 を追加する必要がないことに注意してください。これは、MO1 に入る前にダイクロイックミラーを利用して励起レーザー (ここでは 532 nm) と再帰反射ビームを組み合わせることで簡単に実現できます。ここでは、光トラッピング設定に簡単に統合できる 1 つの可能なイメージング技術 (ライトシート顕微鏡法) のみを実証しました。ただし、これまでのほとんどの研究とは異なり、私たちのシステムでは、（カバースリップやアガロースの使用などの）厳しい物理的制約なしに、対象物をはるかに大きなチャンバー内に閉じ込めることができるため、さまざまなイメージング技術の統合が可能になります（広い視野を備えた) 生体サンプルとその発達をより良く研究するために。したがって、私たちのシステムは、生体物質の特定の動態を研究するために、4D イメージング (経時的な 3D イメージング) の可能性を秘めています。

要約すると、我々は、よく知られた逆伝播光トラッピングシステムの対称性を破ることで全体の光力をどのように変更し、トラッピングの安定性を高め、液体媒体中での長距離粒子の捕捉と操作を可能にするかを実証しました。光ピンセットによる長距離粒子操作に関する報告は数多くありますが、そのほとんどはガスまたは真空媒体中で実行され、主に熱泳動力に依存しています 29,46,47。ここでは、定在波 22 や熱効果を生じさせることなく、放射圧力を利用して、微生物を含むさまざまなサイズや形状の粒子を捕捉し、操作します。レンズと対物レンズの組み合わせによって生成されるトラップ周囲の非対称性により、焦点分離に対するトラップ剛性の感度が極端に低下し、その結果、従来の CP トラップでは不可能だった広範囲の焦点分離でのトラップが可能になります。さらに、崩れた対称性とビームの再帰反射、および 1 つの低 NA 対物レンズのみの使用との組み合わせにより、アライメントが大幅に簡素化されただけでなく、非常に堅牢でコスト効率も高くなりました。提案された ACP セットアップでは、同様の実験パラメータを持つ対称 CP ビームと比較して、軸方向のトラップ剛性が少なくとも 1 桁増加しました。私たちのセットアップはシングルビーム光ピンセットのシンプルさと柔軟性を共有していますが、粒子を捕捉するために非常に小さなNAを持つ対物レンズの使用を可能にします。これにより、望ましくない熱影響を回避しながら、作動距離と視野が大きくなります。これは、液体媒体内で遠距離場での非侵襲的な捕捉と操作が必要な場合に特に興味深いものです。これらすべての利点により、このシステムはさまざまなサンプルの長距離光トラッピングに非常に実用的であり、ここで実証されているように分光ベースの顕微鏡技術の統合の可能性が可能になります。ここ数年、光学ミラートラップ 36,37 (または光学マクロピンセット 41) などの技術はすべて、サンプルの後ろにミラーを使用して逆伝播トラップビームを形成していますが、大きな違いがあることに言及する価値があります。これらの研究のほとんどは空間光変調器 (SLM) を使用しているため、セットアップが非常に複雑で高価になりますが、使用される再帰反射ミラーはサンプルチャンバー内に配置されるため、サンプルの準備と側面イメージングの両方が非常に困難になります。私たちが提案する方法では、ミラー（NF）がサンプルから遠くに配置されているため、特別なサンプルの準備や複雑なイメージング技術を必要とせずに側面からのアクセスが可能になります。さらに、トラッピングビームの独自の非対称性により、ビームの対称性により前述の研究では存在しなかった剛性値が向上し、安定したミリメートル範囲の 3D トラッピングおよび操作機能が実現します。

データは公開されていませんが、合理的な要求に応じて Shima Fardad から入手できます。

Ashkin, A. 中性小粒子、原子、分子の光トラッピングと操作の歴史。 IEEE J. Sel トップクオント。 6、841–856 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

Han, F. & Yan, ZJ 光媒介金属ナノ粒子集合体の相転移と自己安定化。 ACS Nano 14、6616–6625 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Xin、HB et al. 光学力: 基礎から生物学的応用まで。上級メーター。 32、2001994 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

ファルダッド、S.ら。ソレノイドポインティングベクトル場の散乱検出。オプション。レット。 41、3615–3618 (2016)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Corsetti, S. & Dholakia, K. 光学操作: 21 世紀のバイオフォトニクスの進歩。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．オプション。 26、070602 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ギーセラー、J. et al. 光ピンセット—校正から応用まで: チュートリアル。上級オプション。光子。 13、74–241 (2021)。

記事 Google Scholar

ファルダッド、S.ら。金属ナノサスペンション中のプラズモニック共鳴ソリトン。ナノレット。 14、2498-2504 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ガオ、DLら。マイクロスケールからナノスケールへの光学操作: 基礎、進歩、展望。光科学。応用 6、e17039 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Svoboda, K.、Schmidt, CF、Schnapp, BJ & Block, SM 光トラッピング干渉法によるキネシンステッピングの直接観察。 Nature 365、721–727 (1993)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Grier, DG 光学操作における革命。 Nature 424、810–816 (2003)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Bustamante, CJ、Chemla, YR、Liu, SX & Wang, MD 単一分子生物物理学における光ピンセット。ナット。 Rev. Method Prime 1、6 (2021)。

Google スカラー

Bradac, C. ナノスケール光トラッピング: レビュー。上級オプション。メーター。 6、1800005 (2018)。

記事 Google Scholar

Dholakia, K. & Reece, P. 光学的マイクロマニピュレーションが定着。 Nano Today 1、18–27 (2006)。

記事 Google Scholar

Zaltron, A.、Merano, M.、Mistura, G.、Sada, C. & Seno, F. 単一分子実験における光ピンセット。ユーロ。物理学。 J. プラス 135、6 (2020)。

記事 Google Scholar

Yan、ZJ、Sajjan、M.、Scherer、NF 光ピンセットの位相勾配を使用した銀ナノ粒子の材料アセンブリの製造。物理学。レット牧師。 114、143901 (2015)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Ashkin, A.、Dziedzic, JM、Bjorkholm, JE & Chu, S. 誘電体粒子の単一ビーム勾配力光トラップの観察。オプション。レット。 11、288–290 (1986)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

モロイ、JE & パジェット、MJ ライト、アクション: 光ピンセット。軽蔑します。物理学。 43、241–258 (2002)。

記事 ADS CAS Google Scholar

バトラー、C.ら。生体分子、細胞、組織のイメージング、操作、および分析 X 36–41 (SPIE、2012)。

Google スカラー

Ashkin、A. 放射圧による粒子の加速と捕捉。物理学。レット牧師。 24、156 (1970)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Constable, A.、Kim, J.、Mervis, J.、Zarinetchi, F.、Prentiss, M. 光ファイバー光力トラップのデモンストレーション。オプション。レット。 18、1867–1869 (1993)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Zemanek, P.、Jonas, A.、Sramek, L.、Liska, M. ガウス定在波によるナノ粒子とマイクロ粒子の光トラップ。オプション。レット。 24、1448–1450 (1999)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Cizmar, T.、Garces-Chavez, V.、Dholakia, K.、Zemanek, P. サブミクロンの物体を配送するための光学式コンベアベルト。応用物理学。レット。 86、174101 (2005)。

記事 ADS Google Scholar

Cizmar, T.、Brzobohaty, O.、Dholakia, K. & Zemanek, P. 逆伝播ビームに基づくホログラフィック光学マイクロマニピュレーションシステム。レーザー物理学レット。 8、50–56 (2011)。

記事 ADS Google Scholar

Karpinski, P.、Jones, S.、Andren, D. & Kall, M. 一軸結晶を使用した共鳴ナノ粒子の逆伝播光トラップ。レーザーフォトン。 Rev. 12、1800139 (2018)。

記事 ADS Google Scholar

van der Horst, A.、Oostrum, PDJ、Moroz, A.、van Blaaderen, A. & Dogterom, M. 逆伝播する光ピンセットの動的アレイに捕捉された高屈折率粒子に対する高い捕捉力。応用オプション。 47、3196–3202 (2008)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Zhao、CL 変換可能な光トラッピングシステムの実現のための実践的なガイド。オプション。エクスプレス 25、2496 ～ 2510 (2017)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

ドナート、MG et al. 逆方向に伝播するビームにおけるシリコンナノワイヤの光トラップ、光結合、および回転ダイナミクス。ナノレット。 19、342–352 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Yang、YJ、Ren、YX、Chen、MZ、Arita、Y. & Rosales-Guzman、C. 構造化光による光学トラッピング: レビュー。上級光子。 3、34001 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Gong、ZY、Pan、YL、Videen、G. & Wang、CJ 空気中の単一粒子の光学的捕捉と操作: 原理、技術的詳細、および応用。Ｊ．Ｑｕａｎｔ．分光器。ラディアット。トランスファー 214、94–119 (2018)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Tauro, S.、Banas, A.、Palima, D. & Gluckstad, J. フィードバック制御による逆伝播ビームトラップの動的軸安定化。オプション。エクスプレス 18、18217 ～ 18222 (2010)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

リンドボール、TB 他低 NA の逆伝播光トラップ内に捕捉された複数の粒子の 3 次元イメージングと力の特性評価。 J.ユーロ。オプション。社会ラピッド 6、11057 (2011)。

記事 Google Scholar

デコスター、D. et al. デュアルファイバー光トラッピング用の大量生産可能なポリマーマイクロ流体デバイス。オプション。エクスプレス 23、30991 ～ 31009 (2015)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Bellini, N. et al. フェムト秒レーザーで製造されたモノリシック光ストレッチャーの検証と展望。バイオメッド。オプション。 Express 3、2658–2668 (2012)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガック、J. 他光学ストレッチャー - 細胞を微細操作するための新しいレーザーツール。生物物理学。 J. 80、277 (2001)。

Google スカラー

Jakl, P.、Sery, M.、Jezek, J.、Liska, M.、Zemanek, P. 再帰反射ビームによって影響を受ける軸方向の光トラップの剛性。 J. Opt. 純粋なアプリケーション。オプション。 9、S251–S255 (2007)。

記事 ADS Google Scholar

Pitzek, M.、Steiger, R.、Thalhammer, G.、Bernet, S. & Ritsch-Marte, M. 広い視野を持つ光学ミラートラップ。オプション。エクスプレス 17、19414 ～ 19423 (2009)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ズウィック、Ｓ．ら。ホログラフィックツイントラップ。 J. Opt. 純粋なアプリケーション。オプション。 11、034011 (2009)。

記事 ADS Google Scholar

ヤン、ZJ 他単一銀ナノワイヤの三次元光トラッピングと操作。ナノレット。 12、5155–5161 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Wu、MY、Ling、DX、Ling、L.、Li、W. & Li、YQ 定在波ラマンピンセットを使用したナノ構造の安定した光トラップと高感度の特性評価。科学。議員 7、42930 (2017)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ボウマン、R.ら。ホログラフィック逆伝播光トラップにおける位置クランプ。オプション。エクスプレス 19、9908 ～ 9914 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Yang、ZY、Piksarv、P.、Ferrier、DEK、Gunn-Moore、FJ、Dholakia、K. ライトシート顕微鏡におけるサンプル閉じ込めのためのマクロ光学トラッピング。バイオメッド。オプション。 Express 6、2778 ～ 2785 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Woerdemann, M.、Berghoff, K. & Denz, C. 光位相共役を使用した動的マルチビーム逆伝播光トラップ。オプション。エクスプレス 18、22348 ～ 22357 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Rodrigo, PJ、Perch-Nielsen, IR & Gluckstad, J. GPC ベースの逆伝播ビームトラップ内の 3 次元の力。オプション。 Express 14、5812 ～ 5822 (2006)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

Lialys, L.、Lialys, J. & Fardad, S. 光トンネル: 水性媒体における長距離光トラップと操作。オーサ連続体 4、2535–2542 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Lialys, J.、Lialys, L.、Salandrino, A. & Fardad, S. レーザーと電気光学に関する会議。 FF1A.6 (Optica Publishing Group、2022)。

Mitra, T.、Brown, AK、Bernot, DM、Defrances, S. & Talghader, JJ 吸収粒子のレーザー加速。オプション。 Express 26、6639 ～ 6652 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

リン、LHら。光吸収粒子の光熱電引張り。光科学。応用 9、6 (2020)。

記事 Google Scholar

ジェス、PRT 他単一細胞のラマン顕微分光法用のデュアルビームファイバートラップ。オプション。 Express 14、5779 ～ 5791 (2006)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

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ラウリナス・リアリス, ジャスティナス・リアリス, アレッサンドロ・サランドリーノ & シマ・ファルダッド

I2S、情報科学研究所、カンザス大学、ローレンス、66045、米国

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ブライアン・D・アクリー

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LL と JL はシステムの設計とセットアップ、実験の実施、データの収集を行いました。 SF、AS、BA が原稿を書きました。著者全員が原稿をレビューしました。

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Lialys、L.、Lialys、J.、Salandrino、A. 他。サブミリメートルサイズの粒子と微生物の光学的捕捉。 Sci Rep 13、8615 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35829-7

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受信日: 2023 年 3 月 2 日

受理日: 2023 年 5 月 24 日

公開日: 2023 年 5 月 27 日

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