耐熱性新型コロナウイルス用マイクロニードルワクチンプリンター

Jun 09, 2023

Nature Biotechnology (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

マイクロニードルパッチ（MNP）形式での熱安定性mRNAワクチンの分散製造は、コールドチェーンや訓練を受けた医療従事者の必要性を排除することで、資源の少ない地域社会でのワクチンへのアクセスを強化できる可能性がある。ここでは、スタンドアロンデバイスで MNP コロナウイルス病 2019 (COVID-19) mRNA ワクチンを印刷する自動プロセスについて説明します。ワクチンインクは、mRNA をロードした脂質ナノ粒子と、in vitro で製剤をスクリーニングすることにより高い生物活性が得られるように最適化された溶解性ポリマーブレンドで構成されています。我々は、モデル mRNA 構築物を使用して評価した場合、得られた MNP が室温で少なくとも 6 か月間保存安定であることを実証します。ワクチンのローディング効率とマイクロニードルの溶解は、脂質ナノ粒子に封入された有効なマイクログラムスケールの用量のmRNAを単一のパッチで送達できることを示唆している。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) スパイクタンパク質受容体結合ドメインをコードする mRNA を用いて手動で作製した MNP を使用してマウスを免疫すると、筋肉内投与と同様の長期免疫応答が刺激されます。

低所得国および中所得国のワクチン接種を受けていないコミュニティは、2019 年コロナウイルス感染症 (COVID-19) やその他の感染症が繰り返し発生するリスクが高く1、死亡率が増加し、より危険な変異種の出現を促進し、経済に悪影響を及ぼします2。これらの地域社会での集団ワクチン接種は、コールドチェーン対応の保管・輸送インフラが不十分であったり、医療従事者の数が不足したりするなどの問題によって妨げられている3,4。適切なワクチンを製造するための分散型ローカルシステムは、潜在的な解決策を提供します。これらの地域で有望なワクチン形式は、熱安定性マイクロニードルパッチ (MNP) です 5、6、7、8。 MNP は自分で適用でき、筋肉内 (IM) 注射よりも痛みが少なく、鋭利な廃棄物が発生せず、数か月間保存できるように製剤化でき、さまざまな核酸を含む数種類のワクチンとともに使用されています9、10、11。 12、13、14。新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に関しては、Moderna 社や Pfizer-BioNTech 社が製造した脂質ナノ粒子 (LNP) カプセル化 mRNA ワクチンが、重症疾患の予防に非常に効果的であることが証明されています。我々の知る限り、長期熱安定性を有する MNP を使用した LNP ビヒクルでの mRNA ワクチンの皮内 (ID) 送達はこれまでに報告されていません。

MNP の製造では、低資源地域での展開には理想的であるにもかかわらず、製造、ローディング、拡張性において新たな課題が生じ、開発が遅れています15、16、17、18。正確な投与と適切な皮膚浸透のために、マイクロニードルは鋭く、バッチごとにサイズが一貫している必要があります19。 MNP は、特に不安定な抗原を安定化するために賦形剤が必要な場合、ワクチンの充填に利用できる容量が少ないため制限されます 20。 MNP は通常、遠心分離などの労働集約的で手動かつ不正確な手順を経て個別に手作りされるため、これらの方法を使用した一貫した自動製造は困難です21。

ここでは、LNP カプセル化 mRNA ワクチンまたはその他のカーゴを搭載した溶解可能な MNP を製造するためのマイクロニードルワクチンプリンター (MVP) について説明します (図 1a–c)。スタンドアロンのモジュール式デバイス内にマイクロニードル製造プロセスを統合するには、独特の課題が生じます。マイクロニードルの形成は、通常、成形 22、液滴製造 23、インクジェット印刷 24、25、または 3D 印刷 26、27、28 によって実現され、鋭く、正確で、ミクロンスケールの特徴を備えたマイクロニードルを製造する必要があります。金型の充填は、無駄を最小限に抑え、可動部品を減らし、ユーザーの介入を必要とせず、自動化可能な機械駆動のワークフローに統合する反復可能なプロセスによって実行される必要があります。各実行で、MVP は、真空を使用して型内の空気を除去し、インクを破壊することなくワクチンインクをマイクロニードル型に充填し、人間の介入を最小限に抑えた自動化されたワークフローを使用して乾燥を加速します。自動化されたワークフローには、高精度ロボットディスペンサー、プログラム可能な真空チャンバー、再利用可能なマイクロニードルモールドを含むモジュラーモーションステージが統合されています。このデバイスで使用されるプロセスは真空アプリケーションに基づいており、幅広い MNP 設計と互換性があり、ワクチンの無駄を最小限に抑えるように最適化されています。

a、mRNA、脂質、ポリマーを含むモジュール式インクは、マイクロニードルワクチン印刷用にカスタマイズできます。 b、c、MVP (b) を遠隔地に配布して、熱安定性 MNP のローカル製造機能 (c) を提供できます。 d. 自動分注後、PDMS を通して真空を適用し、ポリマー - ワクチン溶液をマイクロニードル型に充填します。次に、金型は乾燥ステーションに移送され、乾燥が促進されます。 e. ポリマーワクチン溶液を PDMS 型に充填するのに必要な時間を、さまざまな設計パラメータとプロセスパラメータについて測定しました。ポリマータイプを除くすべての比較には、対応のない両側 t 検定を使用しました。ポリマータイプでは、通常の一元配置分散分析が使用されました (n = 3 個の独立したサンプル)。 f、さまざまな乾燥戦略の乾燥速度。 ANCOVA を使用して、乾燥速度データの線形回帰から導出された乾燥速度推定値を比較しました (n = 3 個の独立したサンプル)。 g、総滴面積 (n = 3 個の独立したサンプル) およびパッチ適用範囲 (n = 100 個の独立したサンプル) は、分注に使用されるポリマー溶液の関数です。 h、デバイスで製造されたMNPのイメージング：アクリル固体バッキング上のMNP（左上）、円錐（右上）およびピラミッド（左下）の幾何学形状を有するMNP、および単一ピラミッドMNP（右下）のSEM画像。 i. モデルカーゴとして赤 (上) または青 (下) の染料を使用し、デバイスと同時に分配されたチップ搭載型 MNP (白で囲まれた) の画像。 j、MNP 生産スループット。 k、乾燥時間と印刷トレイの長さの関数としての MNP スループット。データは、平均±標準偏差 (e、g) または平均 ± 95% 信頼区間 (f) を表します。 P 値は次のように表されます。 *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。 NS、重要ではありません。

マイクロニードル印刷では、安定化溶解性ポリマーを一貫して塗布可能な mRNA-LNP インクに組み込む必要があります。インビトロでインクを徹底的にスクリーニングした結果、溶解性ポリマーの組み合わせにより活性型 LNP カプセル化 mRNA をうまく送達でき、室温で少なくとも 6 か月間安定性を維持できることが判明しました。我々は、SARS-CoV-2スパイク（S）タンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）をコードするmRNAを用いて、MVPによって産生されたMNPが十分な機械的特性を有し、生体外適用時にブタの表皮にうまく浸透することを示した。手動で生成された MNP の in vivo テストでは、IM 投与と同様の免疫応答が実証されました。

私たちは、粘性のあるワクチンインクを金型に押し込むための真空ベースの技術を開発しました。このプロセスは、空気の透過性とポリジメチルシロキサン (PDMS) への溶解性に基づいています29。充填中に PDMS モールドの底部に直接真空を適用する (図 1d および拡張データ図 1a)、または充填直前に PDMS モールドを事前に脱気する (拡張データ図 1b) ことにより、ポリマーとワクチンの粘稠な溶液が得られます。金型にロードすることができます (補足ビデオ 1 および 2)。

ロード時間と MNP 形成に対するさまざまなプロセスと設計パラメータの影響が、両方のアプローチについて研究されました (拡張データ図 1c–j)。金型に直接真空を適用する場合、負荷時間は、PDMS シートの厚さと組成、PDMS 金型の下に真空を適用するために使用されるパターン、および適用される圧力勾配によって異なります (図 1e)。粘度が増加したインク (拡張データ図 1k) の装填に必要な時間は 20 分未満でした。マイクロニードルの製造中に真空を適用するのは一般的ですが、通常、真空は型の上の雰囲気に適用され、その結果、ワクチンとポリマー溶液中に気泡が形成されます 30,31。 PDMS モールドに直接真空を適用すると、気泡の形成が防止され、遠心分離の必要がなくなり、自動化を可能にする反復可能なプロセスが提供され、MNP のサイズや数量に合わせてスケールアップまたはスケールダウンできます。

ワクチンの無駄と乾燥時間を削減するために、マイクロニードルを満たすために必要なワクチンインクの量を可能な限り最小限に抑えました。脱型に耐えるのに十分な機械的強度を備えた乾燥ポリマーの薄く均質なフィルムが得られるようにポリマー濃度を調整しました (拡張データ図 2a)。ディスペンスは、ディスペンスされたインクの滴面積と、乾燥後に形成されるバッキングの真円度によって特徴づけられました。粘度を高めてポリマーとワクチンを乾燥液滴の端に追いやるマランゴニ効果を最小限に抑えることで、金型ごとに充填された針で測定した真円性と金型被覆率を最大化しました（拡張データ図 2b、c）。熱重量分析を使用して乾燥時間を評価したところ、下方の真空と上方の乾燥した真空雰囲気を同時に適用すると、MNP 金型は気泡を形成することなくパッチの乾燥を促進したことがわかりました（図 1f および補足注 1）。

ユーザーの対話とオンサイトトレーニングの必要性を最小限に抑えるために、上記のプロセスはプログラム可能なコンポーネントを使用して自動化されました。一度に最大 100 個の MNP 金型を収容できる、下側 (ローディング) と上側 (乾燥) に真空を備えたカスタム X-Y 移動ステージが製造されました (補足ビデオ 3 および拡張データ図 3a ～ e)。真空ローディングおよび真空乾燥プロセスをロボットアームと組み合わせて、マイクロリットルスケールの精度で繰り返し可能かつプログラム可能な分注を実現しました（補足ビデオ4および5および拡張データ図3f）。分注パターン、分注量、分注高さなどのパラメータは、ワクチンの無駄を最小限に抑え、極薄の裏地を備えた MNP を生成するために最適化されました（拡張データ図 3g–k）。 1 セットの塗布パラメーターを使用して、3 つの異なる溶解性ポリマーシステムが 80% を超えるモールド被覆率で塗布されました (図 1g)。 MVP により、MNP を使用したワクチン送達に一般的な溶解性ポリマーの選択から作られた最大高さ 1,500 μm のピラミッド型および円錐型マイクロニードルの 10 × 10 アレイ (拡張データ図 3l) など、さまざまなマイクロニードル設計の自動製造が可能になりました (図 1h)。）。

MNP の裏付けでワクチンが乾燥すると、追加のワクチン廃棄物が発生します。廃棄物を削減するために、マイクロニードルチップにワクチンを濃縮するために以前に使用されていた 2 段階のチップローディングプロセスを実装しました 8,32。まず、ワクチンを安定させるために必要な最小限のポリマーを含むワクチンインクを型に充填し、乾燥させます。次に、ポリマーのみのインクを塗布し、乾燥させて裏材を形成します（拡張データ図 4a、b）。 MVP は、異なる MNP での赤と青の染料ローディングで実証されているように、複数のカーゴを同時にチップローディングするために使用することもできます (図 1i)。 MVP で印刷されたチップ装着型 MNP は、100% 正確に形成された鋭いマイクロニードルを備えています (拡張データ図 4c)。

数学的モデルは、さまざまな設計パラメーターの関数として 1 日に製造可能なパッチの数を定量化するために開発されました (補足ノート 2 および 3、および拡張データ図 4d-g)。 MVP のスループットは、デバイスのサイズに応じて塗布ステップまたは乾燥ステップのいずれかになる最も遅いプロセスステップによって制限され、両方を理解することが重要であることがわかります (図 1j)。コンポーネントプロセスが常に稼働しており、塗布と乾燥のスループットが等しい場合、連続処理が可能です。乾燥時間やローディングトレイの寸法（図1k）、パッチサイズ（拡張データ図4d）などのパラメータを考慮して、デバイスのスループットを把握するために、さまざまな設計等高線がプロットされました。

第一世代のプリンターは 48 時間で 100 個のパッチを製造できますが、塗布ステージと乾燥領域のサイズと複雑さを変更することで、これを増やすことができます。このモデルは、スループットの向上に向けた設計上の考慮事項を通知するための統合ツールとして使用できます。これは、MVP 内でモジュール式マイクロニードルトレイモールドを垂直に積み重ねるか (拡張データ図 5a、b)、または分注前にマイクロニードルモールドのトレイからガスを除去する前処理ステージを使用して MNP を連続的に製造することによって効率的に達成できます (拡張データ図 5c) ）。将来の設計では、ロボットアームを使用してパッチの取り外しとパッケージングが自動化される可能性もあります (拡張データ図 5d–g)。

次に、MVP を使用して、さまざまな生物製剤、特にタンパク質、DNA、および mRNA をロードした LNP をロードしました。 BSAによる2段階のチップローディングは、1段階のMNP作製と比較して、ローディング効率（マイクロニードルチップで測定される、作製に使用されるカーゴの割合として定義される）を著しく向上させます（図2a）。 2 段階プロセスの最初の段階で使用されるワクチンインクの質量は、高い充填効率が得られるように最適化されました (拡張データ図 6a、b)。製剤質量が減少すると充填効率が増加することが観察されました（拡張データ図 6c）。最適なローディング手順を使用して、MVP を使用して、32 μg の DNA と 90 μg の BSA をチップローディングし、同様のローディング効率で同時に分注しました (図 2b)。 MVPで達成されたローディングは、標準的な実験室技術によってMNPを手動で製造した場合に得られるものと一致し、さまざまな抗原およびベクターの製造プロセスの自動化が成功していることをさらに裏付けました（図2b）。塗布の高さは、負荷のばらつきを減らすために減少しました (拡張データ、図 6d)。 DNA ワクチンのロードは、100 個の MNP モールドを備えたトレイの表面全体で一貫しており (sd = 1.6 μg)、位置の関数として検出可能な傾向はありません (図 2c および拡張データ図 6e)。

a、1 ステップおよび 2 ステップのマイクロニードル装填効率 (n = 6 の独立したサンプル)。 b、手動で作成された MNP の DNA およびタンパク質のローディング効率は、MVP を使用して作成されたものと同様です (n = 4 ～ 9 の独立したサンプル)。 c、MNP モールドの 10 × 10 トレイ全体にわたる MNP への DNA の一貫したローディングを示すヒートマップ。各正方形は個別のパッチです。黒い矢印はワクチンディスペンサーの動きを示します。 d、MNP は安定化ポリマーと 4 つの脂質成分を含む LNP で構成されます。 e、f、fLucをコードするmRNAを封入したLNPをさまざまな水溶性ポリマーと混合し、乾燥させた。懸濁液中の LNP と同様のタンパク質発現を生成するポリマーの組み合わせをスクリーニングするために、再溶解したポリマーでトランスフェクションした後、HeLa 細胞におけるタンパク質発現を測定しました (n = 4 技術的反復)。 g. マイクロニードルは、mRNA-LNP ワクチンを溶解して皮内空間に送達します。 h、Lipid 5またはcKK-E12で作製したLNPについて、マウスの足蹠にMNPを塗布してから6時間後の発光（n = 5の生物学的に独立したサンプル）。 i、IM、手動で作製したMNPと、1μgのfLuc mRNAを含むLipid 5 LNPの印刷されたMNP投与の比較（n = 5の生物学的に独立したサンプル）。データは平均±標準偏差 (a、b、e、f) または平均±標準偏差 (h、i) を表します。対応のない両側 t 検定 (a、b)、通常の二元配置分散分析 (h)、または通常の一元配置分散分析 (i) (Sidak の多重比較検定) を使用しました。 P 値は次のように表されます。 *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。平均、平均。開発、偏差; NS、重要ではありません。

次に、溶解可能なポリマーマトリックスに安定化された mRNA-LNP を組み込んだ MNP の印刷をテストしました。化学的安定性とコロイド安定性の両方を維持する必要があるため、LNP は固体マトリックス中で乾燥することが特に困難です 33。さらに、マイクロニードルで利用できるポリマーの量は限られているため、LNP の凝集を防ぐことが困難になります。 LNP を安定化するための溶解性ポリマーを調査するために、ポリマーと mRNA の質量比を減少させても LNP の安定性を維持する能力に基づいて、溶解性マイクロニードルの製造に一般的に使用されるさまざまな生体適合性ポリマーを比較しました。ホタルルシフェラーゼ（fLuc）をコードするmRNAを封入する直径約147 nmおよび表面電位-2.7±0.6 mVのLNPは、イオン化脂質、リン脂質、コレステロールおよびPEG化脂質を使用して作製されました（図2dおよび拡張データ図7a〜c）34。

次に、LNP をさまざまな可溶性ポリマーと混合し、乾燥させました。乾燥マトリックスの再溶解後、LNP を使用して HeLa 細胞をトランスフェクトし、細胞生存率と fLuc 発現の両方を新鮮な未乾燥 LNP と比較して測定しました。試験した製剤のいずれも、LNP 単独と比較して細胞生存率を損なうことはありませんでした (拡張データ図 7d)。総質量の50％を超えるポリビニルアルコール（PVA）を含む配合物はLNPの安定化に最適ですが（図2e）、他の一般的な溶解可能なMNP材料はあまり機能しません（図2f）。 PVA の遅い乾燥速度 (拡張データ図 7e)、吸湿性および粘度 (拡張データ図 1k) は、ポリビニルピロリドン (PVP - 望ましい機械的特性を備えた速乾性ポリマー) とブレンドすることで克服できます (拡張データ図 7f、g) ) - 安定性を犠牲にすることなく、LNP は MNP ポリマーマトリックスの溶解後も無傷です - 直径が適度に増加し (拡張データ図 7h)、透過型電子顕微鏡 (TEM) での典型的な構造 (拡張データ図 7i–k) が示され、保存されていますmRNAのサイズ（拡張データ図7l）。

我々は、構造とpKaが非常に異なる2つの異なる主要なイオン化脂質であるcKK-e12と脂質5から、MNPによるID投与に適したLNP製剤（図2g）を選択しようとしました（参考文献34、35、36）。 cKK-e12は、静脈内（IV）投与によるオリゴヌクレオチドの送達に効率的であることが広く報告されているのに対し、リピッド5は、IMおよびIV送達の両方について研究された脂質ファミリーから選択されました。 fLuc mRNA を封入する各タイプの LNP の特性を調べ（拡張データ図 7a ～ c）、最も安定化する溶解性ポリマー配合物と最も効率的なローディング方法、つまり PVP:PVA 1:1 の質量比と、２段階の製作。 MNP の 100 本のマイクロニードルのそれぞれに封入された mRNA 負荷を測定しました。 MNP 内の mRNA 分布は不均一であるにもかかわらず、バッチ間の変動は低く、MNP あたり約 1.0 μg の mRNA チップがロードされていることがわかりました (拡張データ図 7m–p)。 LNPまたはマイクロニードルパッチから再溶解したLNPによるHeLaトランスフェクション後のタンパク質発現は、MNP製造プロセスがin vitroでのLNP活性に影響を及ぼさないことを示しました（拡張データ図7q）。 MNP をマウスの足蹠に適用し、fLuc 発現を発光を使用して測定しました 37。 Lipid 5を含むLNPは、用量反応においてcKK-e12よりもはるかに多くのタンパク質発現を示し（図2h）、ID送達におけるさらなる使用が期待できることが示されています。

MNPを使用したLNPベースのmRNAワクチンのID投与を調査するために、LNPにカプセル化されたfLuc mRNAを使用してin vivoでのタンパク質発現を再度測定しました。今回は、MNPのIDフットパッド適用とLNP内の等量のfLuc mRNAのIM投与を比較しました（図） .2i)。 LNP が IM 注射よりも MNP を介して送達された場合、24 時間でのタンパク質発現が大幅に高くなります。また、MNP を手動で製造した場合と MVP を使用して印刷した場合のタンパク質発現も比較しました。自動印刷プロセスは、生体内での LNP 活性に影響を与えません (図 2i)。

我々は、LNP を安定化するのに最も優れたポリマーを組み合わせて製造した MNP の機械的および機能的特性を評価しました。円錐針とピラミッド針は両方とも、さまざまな送達可能量と先端角度を提供する潜在的に実行可能な形状と考えられており（拡張データ図8aおよび補足表1）、皮膚の浸透と溶解に影響を与えることが示されています38。ピーク力（図 3a）と剛性（図 3b）の両方の点で、PVP:PVA で作られたピラミッド型 MNP は、同じ組成の円錐型 MNP よりも優れており、すべての MNP が皮膚を貫通するための最小要件を満たしています 39。両方の形状について、生体外のブタの皮膚穿刺（図3c）は組織学によって評価され、マイクロニードルの溶解は光学顕微鏡画像分析によって評価されました（図3d、eおよび拡張データ図8b）。どちらの形状でも真皮にアクセスできますが、錐体マイクロニードルの体積の 36% が 10 分以内に溶解しましたが、円錐形のマイクロニードルの体積はわずか 8% であり、より多くのワクチン送達が可能になりました。これはおそらく先端の角度が小さく鋭いため 40 です。したがって、ピラミッド MNP は以下のすべての実験に使用されました。ブレンド中の PVP (拡張データ図 8c ～ e) および LNP (拡張データ図 8f) の割合を増やすと、溶解量を増やすことができます。

a、b、PVP:PVA から作られたピラミッド MNP は、同様のサイズの円錐形 MNP よりも剛性が高く (a)、強度が高くなります (n = 10 の独立したサンプル)。対応のない両側 t 検定。 c. 円錐形およびピラミッド形の MNP は両方とも、ID 送達のために表皮 (e) を貫通 (黒い矢印) し、真皮 (d) にアクセスすることができます。 d、e、適用前後の光学イメージングを使用すると、ピラミッド型MNPは円錐型MNPよりも大幅に速く溶解します（n = 3の独立したサンプル）。対応のない両側 t 検定。 f、GMTは、SARS-CoV-2 RBD mRNAのIMとMNPの間で類似しています（n = 5の生物学的に独立したサンプル）。通常の二元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定)。 g、11週目までの抗RBDタンパク質IgG力価。MNP投与とIM投与の間の体液性反応の異なる動態と、SARS-CoV-2 RBD mRNAに対する同様の反応を示します（n = 5の生物学的に独立したサンプル）。 h、SARS-CoV-2 RBD mRNAによるIMおよびMNPに対して同様の応答を示す、SARS-CoV-2変異体に対する電気化学発光血清抗RBD結合アッセイ応答（n = 5の生物学的に独立したサンプル）。通常の二元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定)。 i、PVP:PVA は、室温で 6 か月間保存した後、MNP 内の mRNA-LNP を安定化して高タンパク質発現を実現します (n = 5 の生物学的に独立したサンプル)。各データセットは線形近似でプロットされ、95% 信頼区間は網掛けで表示されます。ｊ、一般的なｍＲＮＡワクチンについてヒトにおける用量要件を満たすための設計関係。単一のマイクロニードルの体積、ＭＮＰ当たりのマイクロニードル、および単一のＭＮＰで送達される用量の間の関係を示す。黒い矢印は、これらの研究で使用された一定の単一マイクロニードル体積に対してヒト用量のmRNAが満たされるサイズ（MNPあたりのマイクロニードル）を示します。データは平均±sd（a、b、d）または平均±sem（f–i）を表します。 P 値は次のように表されます。 *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。 MPa、メガパスカル。 N、ニュートン。 NS、重要ではありません。

MNP による投与用の SARS-CoV-2 ワクチンを開発するために、BNT162b1 ワクチンの構築物と同様に、T4 三量体化モチーフで修飾された RBD をコードする mRNA を使用しました (拡張データ図 9a)41。 2 段階のローディングの前に、SARS-CoV-2 mRNA を含む LNP を水中で透析し、遠心濾過を使用して濃縮して、MNP ローディング容量を増加しました（拡張データ図 9b、c）42。 LNPの場合、より小さなMNPを作成することによってローディング効率も向上しました。これにより、マランゴニ効果がパッチの周囲ではなくマイクロニードルで覆われた領域に限定されます（拡張データ図9d、e）。それ以外の場合、MNP は、図 3 と図 4 で説明した 2 段階の負荷に従って製造されました。 1 および 2 では、PVP:PVA 1:1 を 0.32 質量比 (mg µg –1) で使用して LNP とイオン化脂質リピド 5 を安定化し、皮内タンパク質発現を最大化します。 HEK細胞を使用して、SARS-CoV-2 mRNAベースのベクターの発現を確認しました（拡張データ図9f）。

以前の報告に基づいて、我々はマウスモデルを使用して SARS-CoV-2 ワクチンの免疫原性を評価しました43。ワクチンは、C57BL/6 マウスの足蹠に MNP を介して 6 μg のカプセル化 mRNA の用量で投与され (拡張データ図 9g-i)、28 日後に MNP 追加免疫が投与されました (拡張データ図 10a)。対照として、10μgのmRNA用量のmRNA-LNPの懸濁液を、同じスケジュールで後肢にIM注射によって投与した。血清を 2 週間ごとに収集し、抗 RBD IgG の結合力価を分析しました。追加免疫の3週間後に、RBD mRNAワクチンについてIMとMNPの間で同様の幾何平均力価（GMT）を測定しました（図3f）。初回刺激後の反応は、異なる mRNA と脂質を使用する C57BL/6 モデルで認可された SARS-CoV-2 mRNA-LNP ワクチンについて報告されているものよりも低いですが、追加免疫後の反応は同様です 43,44。

mRNA-LNPを投与されたすべてのマウスは最終的に高いGMTを生成しますが、IM投与を受けたマウスは追加免疫に対して1週間以内に反応するのに対し、MNP経由で投与されたマウスは追加免疫に対して3週間以内に反応しました（RBD mRNA、図3g）。我々はまた、MNP投与後のFLuc発現の動態がIM投与よりも遅いことも観察した(拡張データ図10b)。これは、mRNA-LNP が MNP を介して固体マトリックスから皮膚に溶解していることを考えると予想されますが、タンパク質発現の遅延は、液体懸濁液の投与と比較した免疫応答の遅延を説明するのに役立つ可能性があります。わずかに低いものの同様のピークGMT（図3f）とSARS-CoV-2感染との防御相関を考慮すると、それでもRBD mRNA MNPは投与後可能な時間内に強力な免疫応答を引き起こしました45。多重電気化学発光アッセイを使用して、目的の異なる変異を持つSARS-CoV-2 Sタンパク質変異体に対する血清抗RBD結合応答を調査し、MNPワクチンによって提供される防御の幅広さを実証しました（図3h）。

マウスにおけるタンパク質発現のモデルとして fLuc mRNA を使用し、マイクロニードル mRNA-LNP 送達用に開発された PVP:PVA ブレンドを、同じ用量で IM 投与された従来の mRNA-LNP 懸濁液と比較しました。両方を室温および 4 °C で保存し、1 か月、3 か月、および 6 か月後に in vivo で評価しました。 IM 懸濁液の効力は 6 か月にわたって低下しますが、MNP は、室温で保存した場合でも、保存期間全体にわたって一貫して高い発光を生成します (図 3i)。 MNP は、37 °C で 1 か月間保存した場合でも mRNA-LNP を安定に維持します。これはプライムとブーストの間の保存時間と一致します (拡張データ図 10c)。同様の研究では、RBD mRNA MNP は、mRNA-LNP 懸濁液で初回刺激した BALB/c マウスのブースターとして使用した場合、室温および 4 °C で少なくとも 3 か月間保存した後でも免疫原性を示します (拡張データ図 10d)。

MNP を使用して十分な用量の LNP ワクチンを送達することは、LNP を安定化するために必要なポリマーの質量により困難です。抗 RBD 力価のピーク研究からの針の体積と MNP 装填効率を使用して、完全なモデルナ (mRNA-1273) を送達するために必要なマイクロニードルの体積と数の組み合わせを予測するモデル (図 3j および補足注 4) を設計しました。 ) または Pfizer-BioNTech (BNT162b1) COVID-19 ワクチンの投与量。このモデルは、研究されたピラミッド型マイクロニードルと製剤のうち 360 個と 108 個が、それぞれモデルナとファイザー・ビオンテックのワクチンの全用量を送達すると予測しています。十分な線量を含む MNP は直径 2 cm 未満です。

体液性反応の大きさは似ていますが、mRNA-LNP懸濁液のIM投与とMNPを使用したmRNA-LNPのID送達との間に興味深い違いが観察されました。 Lipid 5を組み込んだmRNA-LNPは、タンパク質発現の点でcKK-E12を含むmRNA-LNPよりも優れており（図2h）、MNPがイオン化可能な脂質組成に敏感である可能性があることを示唆しています。イオン化脂質はタンパク質の発現とターゲティングを制御し、さまざまな臓器や投与経路に合わせて最適化されています 34、35、46、47。体液性反応もより速くIMを発症します（図3g）。マイクロニードルベースのワクチンに関するこれまでの研究では、投与方法と体液性反応の動態との関連性が示唆されています 48,49。これは、MNP マトリックスの溶解が遅いこと (拡張データ図 10b)、または ID と IM 投与の基本的な違いを反映している可能性があります。これらの違いは、MNP によって送達される mRNA-LNP の効力をさらに調査し、操作する機会を強調しています。さらに、RBD mRNA 構築物は、安定性が向上したワクチンの標的としてさらなる研究が必要になる可能性があります 50。

mRNA-LNP を含む MNP は、ワクチン投与を合理化し、ワクチンの有効性を向上させる新たな機会を提供します。弱毒化ウイルス、ウイルス様粒子、およびその他のワクチンの ID 投与では、IM または皮下経路と比較して用量を節約できる可能性があります 51,52。世界保健機関の専門家戦略諮問グループの会議では、ポリオワクチンのコストを削減する手段として、ワクチンのID配送が推奨され、インドではジェット注射器を介してIDで配送されるDNAワクチンの緊急使用が認可された53,54。室温で安定したワクチンは、冷蔵輸送に必要なサプライチェーンが不十分な可能性がある発展途上国での展開を大幅に促進するでしょう。また、潜在的な流行に備えてワクチンをコスト効率よく備蓄することも可能になります55。特に、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）ワクチンの配備は、保存期間が短いことと、コールドチェーンの保管および輸送システムへの依存によって妨げられている。私たちの知る限り、現在まで、熱安定性 mRNA-LNP ワクチンは開発されていません 33,56。これはおそらく、そのナノ粒子の性質 (たとえば、非常に高い表面積) と不可逆的に凝集する傾向があり、乾燥状態で安定化することが非常に困難であるためです。配合33,57,58,59。

MVP によって印刷された MNP ワクチンは室温で保存でき、製造後数か月は予防接種に使用できることを示します。対照的に、現在の特定の mRNA ワクチンは、長期保存の場合は -60 °C ～ -80 °C、短期保存の場合は 4 °C で保存する必要があります。モデリングデータは、ヒト用量のmRNA-LNP COVID-19ワクチンを2cm四方のマイクロニードルパッチに製剤化できることを示唆しています（図3j）。これは、パッチサイズが大きくなっても針と針の間隔が維持されることを前提としていますが、最終的に変換するには、より大きなパッチの皮膚浸透と針の溶解を評価する必要があります。ヒトに適用するためのエンドツーエンドのマイクロニードル製造プロセスを開発するには、微生物負荷を軽減するための無菌容器や統合されたパッケージングステップなど、MVP の追加エンジニアリングが必要となります 60,61。このデバイスは、特定の領域で対象となる疾患に対するあらゆる mRNA ワクチンに簡単に適合でき、MNP ワクチン生産の望ましい規模に応じたサイズにすることができると考えています。

MVP は、最小限のオペレーターのスキルレベルで、輸送に適したフォームファクターで、MNP の製造に必要な材料を完成した MNP に変換するために必要な機能を統合および自動化するという要件に基づいて設計されました。結果として得られた設計は、ロード、ディスペンス、乾燥という 3 つの主な機能で構成されました。これら 3 つの機能は MVP (拡張データ、図 3f) に編成され、同時に機能するようにプログラムされました。 MVP に関連するすべてのプログラミングは、EPSON RC 7.0 SPEL プログラミング言語で実装されました。オペレーターは、金型をロードし、液体配合物とポリマーバッキング用のリザーバーを充填し、MNP をアンロードする必要があります。

重要な操作機能は、分注ステップ中に最初に液体製剤が MNP の金型の上に分注され、次にその下の真空を使用してネガ型キャビティ内に引き込まれ (約 15 分かかります)、その後ローディングステージが乾燥時間を短縮するために雰囲気が密閉された乾燥ステーション。

分注ステージは、シリンジポンプ (Harvard PHD 2000) と、チューブを介してシリンジポンプに接続された一対のノズル (色素溶液用の 18 ゲージ針、ワクチン印刷用の 25 ゲージ針) を保持するロボットアーム (Epson T3) で構成されます。ロボットアームの動作はシリンジポンプと同期するようにプログラムされました。ロボットアーム/ポンプの動作は、液体配合物による MNP モールドの範囲を最大化するために最適化されました。パッチ間の滴下とワクチンの無駄を最小限に抑えるために、隣接する 2 つの MNP 間に投与時間のギャップが課されました。

どちらのプロセスも、PDMS モールドに真空を適用し、ポリマー溶液 (染料または生物学的薬剤を充填) を分配し、その後真空乾燥するという異なるシーケンスに基づいていました。最初のプロセス (脱気) では、最初に空の PDMS モールドに真空を適用し、続いて真空適用直後に特定の時間 (約 7 分) 以内にポリマー溶液を分注し、最終的にポリマー溶液を真空で乾燥させました。真空脱気により、PDMS モールドのマイクロニードルキャビティへのポリマー溶液の拡散が促進されました (拡張データ図 1b および補足ビデオ 1)。 2 番目のアプローチでは、ポリマー溶液を PDMS 型に塗布し、その後シートの下と上の両方から真空を適用して (拡張データ図 1a および補足ビデオ 2)、ポリマーの拡散を誘発するだけでなく、乾燥時間を短縮します。気泡の形成なし。真空を使用して溶液を乾燥する場合、PDMS シートの下でより高い負圧を維持することで、PDMS モールド内の圧力勾配を維持することが重要です。そうすることで、ポリマーとワクチンの溶液に溶けた空気が下方（PDMS モールドの下の真空チャンバーに向かって）に移動し、乾燥中の気泡の形成が回避されます。自動化が簡単なため、2 番目のアプローチがさらにデバイスに実装されました。

ローディングステージはカスタムメイドの 10 × 10 アレイの MNP モールドで、PDMS シートの下に真空 (-1 bar) を適用するために使用されました。ローディングステージは単軸モーションステージ (Thorlabs) に固定されており、ローディングステーションと乾燥ステーション間の移動が可能でした。配合物を分配する前に、装填ステーションと分配ステーションとの位置合わせを校正した。

乾燥ステージは、単軸モーションステージ (Thorlabs) を介して垂直に移動する特注の真空チャンバーでした。ヘッドカバーには真空接続部と乾燥剤バッグが含まれていました (拡張データ図 3c)。乾燥を促進するために、真空を-0.6 barに設定しました。装填段階と乾燥段階の両方に単一の真空ポンプを使用しました。真空ポンプはローディングステージに直接接続され、圧力コントローラーを使用してヘッドカバー内の真空度を -0.6 bar まで下げました。ローディングステージ内部と比較してヘッドカバー内の真空度が低いため、PDMS モールドのシート内で負の圧力勾配が維持され、MNP 溶液内での気泡の形成が回避されました。さらに、圧力コントローラーを使用して、乾燥後に乾燥ステージを自動的に大気圧に戻し、真空チャンバーをローディングステージから解放しました。

パッチ (n = 100) を MVP で分配し、乾燥させて、個々の MNP の異なる乾燥パターンによって引き起こされるパッチ適用範囲に対する液体製剤の影響を研究しました。液体配合物には、ＰＢＳに２０％（ｗ／ｗ）で溶解し、染料と混合したポリマー配合物（ＰＶＰ、ＰＶＡ、ＰＶＰ：ＰＶＡ１：１）が含まれていた。パッチ被覆率は、乾燥後に正常に形成されたマイクロニードルの数を、製造可能なパッチの総数 (100) で割ったものとして定義されました。パッチ被覆率は、各製剤の光学顕微鏡下でパッチごとに個別に定量化されました。ドロップ領域と円形度は、イメージング後の画像解析を使用して定量化されました。

ワクチンやその他の生物学的貨物の積み込みには、2 段階の分配アプローチが採用されました。最初のステップでは、ワクチン溶液を分注針 (25 ゲージ、BD Biosciences) を通して分注チューブ内に吸引しました。最初のステップの液体製剤は、PVP:PVA 1:1、4% (w/w) と混合された特定の濃度の生物学的因子で構成されていました。次に、約 36 ± 6 μl のワクチン溶液 (または他のカーゴ) を、一対の 1 ml シリンジ (BD Biosciences) を使用して、分注トレイ上の MNP モールドの中央に分注しました。分注ロボットを金型から金型に移動する際のワクチンの無駄を最小限に抑えるために、隣接する 2 つの MNP のそれぞれを分注する間に 9 秒の時間差を設けました。バッキング溶液 (PVP:PVA 1:1、20% (w/w)) を新しい分注シリンジ (10 ml サイズ、BD Biosciences) に直接吸引しました。第 2 段階では、48 ± 6 μl の量のバッキング溶液を、先に分注した (乾燥させた) ワクチンスポットの真上に分注しました。各分注ラウンドの前後に、針とチューブをエタノール (70%)、続いて滅菌水で洗浄しました。いくつかの実験では、各シリンジ/針が異なるカーゴを分配するように、一対のカーゴが同時に分配されました。この場合、各シリンジに異なるカーゴが装填されることを除いて、単回分注の場合と同じ装填/分配手順に従った。

SolidWorks 2021 (Dassault Systèmes) は、MVP、ロボットアーム、分注ステーション、真空装置、陰圧チャンバー、無菌環境コンテナ、乾燥ラック、コンベアベルト、および自動マイクロニードルパッチ脱型ステーションの 3D イラストレーションに使用されました。 Epson T3 ロボットアームの図面は、Epson の公式 Web サイトから直接ダウンロードされました。 XYZ プロッター、乾燥ラック、コンベアベルトのモデルは GrabCAD からダウンロードされました。他のすべての部品は、プロトタイプ部品の実際の寸法を参照してカスタム設計されました。

実験計画法 (DOE) アプローチに従って、ロボットノズル (ニードル) から個々の PDMS アレイに分注される出力応答として、液滴の集合サイズに対するさまざまな設計パラメーターの影響を体系的に研究しました。この目的を達成するために、L18 直交配列実験計画法 (Taguchi DOE) をソフトウェア (Minitab) で構築しました。以下の設計パラメータの影響を研究しました: (1) ノズルへの 0.2 µm フィルターの取り付け、(2) ニードルゲージ、(3) 吐出高さ、(4) 吐出流量、および (5) ポリマー粘度ポリマー組成の機能。各分注終了時の総液滴の投影された液滴面積を、ImageJ ソフトウェアを使用して定量化しました。結果 (n = 3 ～ 5) を Minitab で分析し、これらのパラメータの変化の関数として滴面積の平均応答を求めました。実験セットアップの概略図を拡張データ図 3g に示します。総分注量は一定であり、200 μl に等しいとみなされました。総分注量を一定 (200 μl) に保ち、分注時間を変えることで、異なる流量を実現しました。

自動 MVP を使用して MNP を印刷し、光学顕微鏡で画像化して、マイクロニードルが全長で鋭利であるかどうかを判断しました (n = 30)。画像解析を使用して針の高さを推定しました。

走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して、製造されたマイクロニードルを画像化しました。最初に、Hummer 6.2 スパッタリングシステム (ANATECH) を使用してサンプルを Au/Pd の薄層でコーティングし、次に加速電圧 5 ～ 10 kV の JSM-5600LV SEM (JEOL) を使用して画像化しました。

スチール MNP ポジティブを使用して PDMS (Sylgard 184、Dow Corning) 製のネガティブモールドを生成し、メーカーの指示に従って混合し、60 °C で一晩硬化させました。追加の MNP ポジティブを作成するために、3,234g で 1 分間遠心分離機を使用して、UV 硬化性 Norland Optical Adhesive 61 を PDMS ネガティブモールドに充填し、室温の UV 硬化オーブンに 20 分間置き、手動で取り外しました。

ネガモールドのトレイを作成するために、まずレーザーカットされた 5 × 5 アクリルグリッドを使用して MNP ポジティブを位置合わせしました。次に、Norland Optical Adhesive 61 を個々の樹脂ポジの複製の間に注ぎ、室温で 20 分間 UV 硬化し、60 °C で一晩保持しました。得られた等間隔の 5 × 5 ポジティブ MNP のトレイ (拡張データ図 3d) を使用して、ネガティブモールドの 5 × 5 PDMS シートを作製しました (拡張データ図 3e)。 PDMS を使用して、位置合わせされた樹脂ポジをカバーし、ポジの上に PDMS の追加の 1 mm 層を作成しました。シートを平らにし、60 °C で一晩硬化させ、イソプロパノールを使用して除去して、ネガとポジを分離しました。

MNPは、20% w/w PVP、PVA、またはPVP:PVA溶液200μlをPDMS型にロードして乾燥させることによって作製しました。色素、LNP、DNA、またはタンパク質を MNP にロードする場合、2 段階のロード手順が使用されました。まず、0.8 mg、1.6 mg、2 mg、または 8 mg の PVP:PVA およびさまざまな量の LNP (カプセル化された mRNA 質量として表現)、タンパク質、または DNA を含む脱イオン (DI) 水または PBS 溶液 200 μl をロードし、乾燥させた。次いで、可変容量の脱イオン水またはＰＢＳ中２０％ｗ／ｗのＰＶＰ：ＰＶＡを使用して、総ＭＮＰ質量を４０ｍｇのＰＶＰ：ＰＶＡとした。そのポリマー溶液を充填し、乾燥させて、薄いポリマー裏材を作成した。 in vivo 研究で使用されたすべての MNP は、特に指定がない限り、手動分注を使用して製造されました。 LNP、DNA、またはタンパク質がロードされたすべての MNP は、-1 バールゲージ圧で線のあるパターンを使用して金型を通して真空を適用し、-0.6 バールゲージ圧で乾燥チャンバー内に真空を適用することによって製造されました。

ワンステップ製造法の場合、40 mg の PVP:PVA をさまざまな量のタンパク質と混合し、ワンステップで追加しました。

PDMS ネガ型にインクを充填するのに必要な時間を、電子顕微鏡で充填を記録することによって評価しました (n = 3)。顕微鏡を PMDS モールドの側面に置き、透明な PDMS を通してマイクロニードルに焦点を合わせました。

ポリマー溶液を PDMS 型に充填し、0 から -0.5 バールゲージ圧のさまざまな真空値でさまざまな時間、脱気しました。脱気と充填の間の時間は、5 ～ 10 分から 1 時間まで変化しました。次に、MNP を乾燥させ、PDMS 型から取り出しました。 PDMS 型に移動するポリマー - 染料溶液の光学画像は、溶液を型に加えてから 0 分、2 分、5 分、10 分後に取得されました。これらの画像から、画像解析を使用して針の高さを推定しました。

ポリマー溶液（n = 1）は、40 mm 平行プレートと 0.01 s-1 から 5,000 s-1 のせん断速度ランプを使用する TA Instruments Discovery HR-2 レオメーターを使用して特性評価されました。

50 μg、100 μg、または 200 μg の BSA および 0.8 mg、4 mg、または 8 mg の PVP:PVA (2 段階チップローディングの場合) をロードした MNP の針を切断し、脱イオン水に溶解しました (n = 6)。ビシンコニン酸アッセイ (BCA) (Thermo Fisher Scientific) を使用して、96 ウェルプレートの標準手順を使用してタンパク質負荷を定量しました。 PVP と PVA の内部標準は、それらの干渉を考慮して検量線に追加されました。検量線に追加される PVP および PVA の量は、針の体積 (0.08 mm3)、密度 1.2 g/cm3、および BSA 定量に使用した針の数 (希釈に調整) に基づいて計算されました。

手動製造と自動製造のローディング効率を比較するために、100 µg の DNA と 1.6 mg の PVP:PVA をロードした MNP の針（2 段階チップローディング）を切断し、Tris-EDTA（TE）バッファーに溶解しました（n = 8)。 NanoDrop を使用して 260 nm および 280 nm での UV 吸収を使用して DNA を定量しました。 PVP は UV 範囲でも吸収するため、その寄与を考慮して同量の PVP を検量線に追加しました。添加する PVP の量は、タンパク質の定量化で説明したのと同じ方法で、PVP 対 PVA 比を 1:1 と仮定して計算しました。これをトレイ位置ヒートマップと DNA によるローディング効率計算でも繰り返しましたが、パッチあたり 10 μg の DNA と 2 mg の PVP:PVA を使用しました。

CleanCap AG キャップ、完全な N1-メチル-プソイドウリジン置換、およびポリアデニル化テール (120 Å) (TriLink BioTechnologies) を使用して、精製 mRNA を得ました。 LNP 合成には、3,6-ビス({4-[ビス(2-ヒドロキシドデシル)アミノ]ブチル})ピペラジン-2,5-ジオン (cKK-E12、Organix)、ヘプタデカンなどのさまざまな高純度脂質が使用されました。 8-((2-ヒドロキシエチル)(8-ノニルオキシ)-8-オキソクチル)アミノ)オクタン酸 9-イル (Lipid 5、Organix)、1-2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン (DOPE、Avanti)、コレステロール (Sigma-Aldrich) および 1-2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩) (C14-PEG2000、Avanti)。 LNP は、以前に説明された手順を使用して調製されました 34、35、36。脂質は、cKK-E12:DOPE:コレステロール:C14-PEG2000 のモル比 35:16:46.5:2.5、または cKK-E12 を使用する場合は 38.4:12.3:47.4:1.9 脂質 5:DOPE:コレステロール:C14-PEG2000 のモル比でエタノールに溶解しました。それぞれイオン化可能な脂質として E12 または Lipid 5。 LNP を調製するために、エタノール溶液を、pH 3 のクエン酸で緩衝した mRNA 溶液に体積比 3:1 (水:エタノール) で迅速に加えて混合しました。 cKKe12を使用する場合、イオン化脂質とmRNAの重量比は10に設定され、最終mRNA濃度は0.1 mg ml-1でした。 Lipid 5 を使用する場合、イオン化脂質と mRNA の重量比は 5 に設定され、最終 mRNA 濃度は 0.135 mg ml-1 でした。すべての核酸は -80 °C で保存され、使用前に氷上で解凍されました。次に、LNP を 20,000 分子量カットオフ (MWCO) カセットで 4 °C の PBS 中で少なくとも 2 時間透析しました 34。 DI 水中の LNP の場合、溶液を 4 °C でさらに最低 2 時間、DI 水に対して透析しました。必要に応じて、LNP を 3,000g で遠心分離することにより Amicon フィルター上で濃縮しました 42。すべての溶液は 4 °C に保存され、1 週間以内に使用されました。

LNP の mRNA 濃度とカプセル化効率は、他の場所で説明されている修正手順を使用した Quant-iT RiboGreen アッセイ (Thermo Fisher Scientific) で推定されました (バッチあたり n = 3)34。簡単に言うと、LNP を TE または Triton X-100 バッファー (TX) と混合した TE で希釈しました。次に、Quant-iT RiboGreen アッセイを使用して、カプセル化されていない mRNA (TE で希釈した場合) と総 mRNA 濃度 (TX で希釈した場合) を定量しました。サイズについては、LNP を PBS で 200 倍に希釈し、Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments) を使用して特性評価しました。 MNP における mRNA 負荷を測定する場合、マイクロニードルを切断し、TE および TX に溶解しました。 MNP バッキングにロードされた mRNA を測定する場合、マイクロニードルを切断し、残りの MNP を TE および TX に溶解しました。全 mRNA からカプセル化されていない mRNA を引くと、カプセル化された mRNA 濃度が得られます。

ポリマーは、溶解度に応じて 10% ～ 30% w/w の範囲の濃度で PBS または DI 水に溶解されました (n = 4)。次に、これらの溶液の重量を量り、LNP 懸濁液と混合して、適切なポリマー対 mRNA の質量比を達成しました。インク混合物を直ちに、デシケーター内のLoBind Eppendorfチューブ内で-0.5バールの真空下で乾燥させた。 24 時間乾燥させた後、インクペレットを PBS に再溶解し、37 °C で 10 分間インキュベートしました。 PBS を使用して、溶解したインク 15 μl にカプセル化された mRNA が 50 ng 含まれるように容量を調整しました。この混合物を使用して細胞をトランスフェクトしました。使用したイオン化脂質はcKK-E12でした。

LNP をロードした MNP の in vitro 評価のために、チップローディングに 10 μg の mRNA と 8 mg PVP:PVA の 2 段階ローディングを使用して 4 つの MNP を製造しました。 2 つの MNP を使用して LNP チップの負荷を定量化し、2 つの MNP を使用して HeLa 細胞をトランスフェクトしました。針を切断し、RNA定量化のために1mlのTE緩衝液に溶解し、細胞トランスフェクションのために1mlのDMEMに溶解した。 LNP合成で説明した手順を使用してmRNAを定量し、以下に説明するようにHeLa細胞をトランスフェクトしました。使用したイオン化脂質はリピッド 5 でした。

HeLa 細胞は、10% FBS (Invitrogen) および 1% 抗生物質 (Invitrogen) を補充したフェノールレッド (Invitrogen) を含む高グルコース DMEM 中で培養されました。次に、10,000 個の細胞を完全増殖培地中の白色 96 ウェルプレートのウェルに播種しました。播種の20時間後、15μlの新鮮なLNPまたは溶解した製剤、または50μlの新鮮なLNPまたは溶解したMNPを増殖培地に添加した。すべての場合において、50 ng のカプセル化 mRNA を各ウェルに添加しました。トランスフェクションの24時間後、100 μlのBright-Glo ルシフェラーゼアッセイキット (Promega) 試薬を加え、Tecan Infinite 200 PRO プレートリーダーを使用して次の 2 分間発光を測定しました。

HeLa 細胞の生存率は、イオン化脂質として cKK-e12 を使用して作成された LNP にカプセル化された 0.6 mg のポリマー製剤および 50 ng の mRNA の存在下で測定されました。各ウェルで 15 マイクロリットルのインクを使用しました。細胞生存率は、製造元 (ab228554) の説明に従って CKK8 アッセイを使用して 96 ウェルプレートで測定しました。

MNP は、最初のステップで 10 μg の mRNA と 8 mg の PVP:PVA を使用する 2 ステップのローディングを使用して作製されました。 MNP の 100 本の針はそれぞれ、顕微鏡下で根元で手動で切断され、アレイ上の位置に基づいて分類されました。 RNA は、LNP 合成セクションで説明したのと同じ方法で定量しました。使用したイオン化脂質はリピッド 5 でした。

FLuc mRNA-LNP をすべてのサンプルに使用しました。 LNP は、(1) PBS への透析後、(2) 320 μg ml-1 まで濃縮後、(3) 4% w/w ポリマー溶液で 200 μg ml-1 に希釈してワクチンインクを形成した後、および (4) で分析されました。乾燥させてMNPを形成した後。サンプルを 20 µl に溶解し、2 秒間ボルテックスし、さらに 200 µl で希釈して混合しました。次に、10 μl の再構成 mRNA-LNP を 490 μl の水で希釈し、2 秒間ボルテックスし、Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments) で動的光散乱 (DLS) を使用して分析しました。サンプル (各グループ n = 5) は、測定前に 60 秒間平衡化されました。各サンプルに対して 3 回の技術的反復が実行されました。

FLuc mRNA-LNP をすべてのサンプルに使用しました。 LNP は、（1）PBS への透析後、（2）320 μg ml-1 に濃縮後、（3）4% w/w ポリマー溶液で 200 μg ml-1 に希釈してワクチンインクを形成した後、および（4）分析されました。乾燥させてMNPを形成した後。溶解したサンプルをカーボンコーティングされた銅製 TEM グリッドに加え、ブロッティングして過剰な溶液を除去しました。次に、1% リンタングステン酸水溶液を使用してサンプルを染色しました。余分な染色液を除去した。サンプルは TEM イメージングの前に室温で乾燥させました。極低温 TEM イメージングの場合、サンプルは 930 Gatan Cryoplunge 3 を使用してプランジ凍結されました。すべてのサンプルは、JEOL 2100 FEG 顕微鏡を使用して 200 kV の加速電圧でイメージングされました。

FLuc mRNA-LNP をすべてのサンプルに使用しました。 mRNA は、(1) メーカー提供に従って、(2) mRNA-LNP 合成および PBS への透析後、(3) 4% w/w ポリマー溶液で 200 μg ml-1 に希釈してワクチンインクを形成した後、および ( 4) 乾燥させて MNP を形成した後。次に、Ultra Sensitivity RNA Kit (FP-1201) を使用して、Agilent Femto Pulse を使用して溶解サンプル 2 μl を分析しました。サンプルは TE または TX バッファーを使用して調製されました。

乾燥のさまざまな時点および段階での製造された MNP の水分含有量は、Pyris 1 熱重量分析装置 (PerkinElmer) を使用し、50 °C から 600 °C まで毎分 20 °C の加熱速度で加熱する熱重量分析 (TGA) によって定量されました。窒素流（20 ml min−1）（n = 3）。含水量は、裏材ではなくセラミックパンに置かれた MNP の針のみを分析することによって評価されました。乾燥速度は、乾燥プロセス全体を通して経時的に測定された水分含有量の線形回帰を使用して推定されました。すべての分析は 3 回繰り返して実行されました。

圧縮試験では、単一の MNP を圧縮プラテン (Instron 2501 シリーズ) の間に取り付け、500 N ロードセルを備えた Instron 5943 を使用して 1 mm min-1 の速度で圧縮しました (n = 10)。マイクロニードルが破損する前のピーク力と、初期圧縮の線形領域の傾きが報告されました。マイクロニードルの故障モードは、テスト後にパッチを画像化することによって決定されました。

ミニバネ式アプリケーター (Micropoint Technologies) を使用して、MNP を切除したブタの皮膚に ex vivo で 2 分間、5 分間、10 分間または 30 分間適用しました (n = 3)。続いて、皮膚サンプルをホルマリン中で 48 時間固定し、その後 70% エタノールに移し、パラフィンワックスに包埋しました。サンプルを切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました。

適用時間の関数としてマイクロニードルの溶解を定量化するために、ライカ DFC450 を使用して、切除した豚の皮膚に適用する前後でマイクロニードルパッチを画像化しました。パッチは、LAS バージョン 4.7 ソフトウェアを使用して画像化するために横方向に配置されました。マイクロニードルの長さは、各パッチの少なくとも 10 個のマイクロニードルについて ImageJ を使用して計算され、これらの測定は時点ごとに 3 つのパッチで実行されました。

すべての動物手順は、マサチューセッツ工科大学動物管理委員会 (1019-061-22) のガイドラインに基づいて承認され、実行されました。生後 6 ～ 8 週の雌 C57BL/6 マウス (Charles River Laboratories) を使用し、安全性を監視しました (n = 5)。 MNPは、上記の2段階ローディング法を使用して、FLucをコードするmRNA-LNP（L-7010、TriLink BioTechnologies）を用いて作製されました。 LNP 用量とイオン化脂質の化学的性質を変化させ、少なくとも 100:1 のポリマー:mRNA 質量比を維持しました。 IV または IM mRNA 投与法用に以前に選択された 2 つのイオン化脂質、それぞれ cKK-E12 (参考文献 34) と脂質 5 (参考文献 35) を研究しました。 MNP は、麻酔を使用していずれかのフットパッドに適用されました。 MNP に含まれる LNP の全用量をより完全に溶解するために、10 × 10 アレイを適用する場合、MNP を 2 つの半分に分割し、同じフットパッドに半分あたり 10 分間連続して適用しました。最初の 1 分間は手の圧力を加え、残りの 9 分間はテープを使用して MNP をフットパッドに固定しました。ポジティブコントロールとして、LNPをPBS中の40μl懸濁液として大腿尾部筋肉に対応する用量で投与した。足蹠が選択されたのは、以前にマイクロニードル適用後の発光の IVIS イメージングに使用されていたことと、ワクチンの ID 投与についてよく研究されている部位であり、流入リンパ節の分離が可能であるためです 62,63。

MNP 適用の 24 時間後、IVIS 動的イメージングシステム (PerkinElmer) でマウスの生物発光をイメージングしました。次に、画像化の15分前に、マウスにRediJect D-Luciferin Ultra (PerkinElmer)を150 mg kg-1で腹腔内注射した。発光は、LivingImageソフトウェア(PerkinElmer)を使用して定量化した。注射部位の光の吸収、拡散、送達深度が IVIS を使用して測定される信号に影響を与える可能性があるため、発光結果の比較は慎重に検討する必要があります。動態実験では、投与後 2 時間、6 時間、24 時間、48 時間、および 72 時間後にイメージングを実行しました。

BioCoat Poly-D-Lysine 4 ウェル培養スライド (354577) のウェルごとに、合計 89,000 個の HEK293 細胞を播種しました。 HeLa細胞と同じ増殖培地を使用しました。播種の24時間後、リピッド5で作製し、RBDをコードするmRNAを封入したLNP懸濁液から、ウェル当たり265ngのmRNAを細胞にトランスフェクトした。 MNP から溶解した LNP は、MNP にロードした後の生物活性を実証するためにも使用されました。 SARS-CoV-2ワクチン接種研究で使用されたものと同じMNPが使用されました。針を切断し、DMEMに溶解し、対照LNP懸濁液と同じmRNA量を使用して細胞をトランスフェクトするために使用した。 MNP の独立した複製のニードルを TE バッファーに溶解し、LNP 合成で説明した手順を使用して、mRNA を定量しました (PVP および PVA も内部標準として RiboGreen の RNA 検量線に追加しました)。播種から 48 時間後、細胞を 37 °C の PBS で 2 回洗浄しました。その後のすべてのステップの間に細胞を PBS で洗浄しました。細胞を室温で15分間平衡化させた。次に、1 ml の Image-iT Fixative Solution (Invitrogen) をウェル (FB002) ごとに添加し、15 分間放置しました。次に、1 mL の eBioscience Intracular Fixation and Permeabilization Buffer (Invitrogen) を加え、10 分間インキュベートしました。次いで、ＰＢＳ中の１％（ｗ：ｖ）ＢＳＡ１ｍｌを室温で１時間添加した。次に、PBS で 100 倍に希釈した SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 (RBD) 組換えヒトモノクローナル抗体 (T01KHu、Thermo Fisher Scientific、703958) 300 μl を各ウェルに加え、1 時間インキュベートしました。 PBS-Tweenを使用して細胞を洗浄しました。次に、PBS で 400 倍に希釈したヤギ抗ヒト IgG (H+L) 交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific、A-11013) 300 μl を二次抗体として使用し、1 分間インキュベートしました。 h. 次に、BSA 1%で400倍に希釈した300μlのローダミン-ファロイジン(Invitrogen R415)染色を細胞細胞骨格イメージングに使用し、30分間インキュベートしました。最後に、DAPI ProLong (Invitrogen、P36982) 1 滴を使用して細胞を固定しました。細胞を共焦点顕微鏡(Olympus FV1000)で画像化した。

すべての動物手順は、マサチューセッツ工科大学動物管理委員会 (1019-061-22) のガイドラインに基づいて承認され、実行されました。生後 6 ～ 8 週の雌 C57BL/6 マウス (Charles River Laboratories) を使用し、安全性を監視しました (n = 5)。 MNPは、上記の2段階ローディング法を使用して、SARS-CoV-2 RBDおよびT4三量体化モチーフをコードするヒトコドン最適化mRNA-LNPを用いて作製されました。 1.5 μg のカプセル化 mRNA を含む小さな MNP アレイを作製し、mRNA の定量化によって検証しました。約 12 本のマイクロニードルを備えた 4 つの MNP を、マウスあたり 6.0 μg の総封入 mRNA 用量として、麻酔下でマウスの左右の足蹠にそれぞれ 10 分間の適用時間で適用しました。最初の 1 分間は手の圧力を加え、残りの 9 分間はテープを使用して MNP をフットパッドに固定しました。陽性対照として、LNPを、マウス1匹あたり10.0μgのカプセル化mRNAを含むPBS中の40μlの懸濁液として右大腿尾部筋肉に投与した。

すべての動物手順は、マサチューセッツ工科大学動物管理委員会 (1019-061-22) のガイドラインに基づいて承認され、実行されました。 MNP は、上記の 2 段階ローディング法を使用し、パッチあたり 1.0 μg の mRNA 用量、ポリマー:mRNA 質量比 500:1 で、FLuc mRNA LNP で作製されました。リピド 5 をイオン化脂質として使用しました。 MNP のサイズと適用は、fLuc 発現に関する上記の研究と同じです (n = 5)。 MNP は、シリカ乾燥剤を入れた容器内でさまざまな温度で保管されました。陽性対照として、リピド 5 で作製した LNP に同量の fLuc mRNA を含む懸濁液を密封したバイアルを、MNP と並べてさまざまな温度で保存しました。

SARS-CoV-2 Spike S1-RBD ELISA 検出キット (L00845、GenScript) を使用しました。プレートを精製組換え SARS-CoV-2 Spike S1-RBD 抗原でコーティングしました。プレートを熱不活化血清の段階希釈物とインキュベートし、37℃で30分間インキュベートしました。ウサギ抗マウス IgG 西洋わさびペルオキシダーゼ結合体 (Abcam、ab6728) の 1:10,000 希釈液を二次抗体として使用し、3,5,3',5'-テトラメチルベンジジン (TMB) を基質として使用しました。内挿されたエンドポイント力価は、ナイーブマウスの血清によって生成されるバックグラウンドの 3 倍を超える光学濃度を放出する希釈として計算されました。

ECLA プレート (Meso Scale Discovery SARS-CoV-2 IgG、N05CA-1、パネル 7) は、各ウェルに 4 つの抗原スポットを備えて設計および製造されました。含まれる抗原は、WA1/2020、B.1.1.7、P.1、および B.1.351 S1-RBD でした。プレートを５０μｌの１％ＢＳＡ溶液で７００ｒｐｍで振盪しながら室温で少なくとも３０分間ブロックした。ブロッキング中、血清をＤｉｌｕｅｎｔ１００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）で１：５，０００に希釈した。プレートを150μlの洗浄緩衝液で洗浄し、ブロットして乾燥させ、50μlの希釈サンプルをプレートに二連で加えた。サンプルを室温で 700 rpm で振盪しながら 2 時間インキュベートしました。二次抗体は、メーカーのガイドライン (R91AO-1) に従って、NHS-エステル化学によって MSD GOLD SULFO-TAG に結合した Jackson ImmunoResearch ウサギ抗マウス IgG 検出抗体 (315-005-045) を使用して調製しました。プレートを再び３回洗浄し、希釈剤１００で１倍に希釈した５０μｌのＳＵＬＦＯタグ付き抗マウスＩｇＧ検出抗体を各ウェルに添加し、７００ｒｐｍで振盪しながら１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した。 150μlのMSD GOLD Read Buffer Bを各ウェルに加えました。各サンプルのMSD力価は相対光単位（RLU）として報告され、各スポットおよびサンプルのブランクを差し引いたサンプルとして計算されました。検出限界は、すべてのアッセイで 500 RLU と定義されました。

1.5 μg のカプセル化された SARS-CoV-2 mRNA を含む MNP を、シリカ乾燥剤を含む容器内でさまざまな温度で保存しました。陽性対照として、200 μg ml-1のSARS-CoV-2 mRNA-LNPを含む懸濁液の密封バイアルを、MNPと並べてさまざまな温度で保存しました。生後 6 ～ 8 週の雌 BALB/c マウス (Charles River Laboratories) を使用し、安全性を監視しました (n = 5)。すべてのマウスに、PBS中の40μlの懸濁液として右大腿尾筋に投与されたmRNA-LNPに封入されたmRNA 10μgの初回用量を投与した。次いで、マウスを、新鮮な対照および1ヶ月または3ヶ月保存されたパッチまたは懸濁液を含む様々な材料で追加免疫した。 MNP グループの場合は、以前の実験と同様に、12 本のマイクロニードルを備えた 4 つの MNP を麻酔下でマウスの左右の足蹠に適用しました。適用時間はそれぞれ 10 分間で、推定合計 mRNA 用量はマウスあたり 6.0 μg でした。 IM グループの場合、mRNA-LNP に封入された 4 μg の mRNA を、PBS 中の 40 μl 懸濁液として右大腿尾筋に投与しました。

統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して実行されました。 P 値は次のように表されます。 *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

これらの研究中に生成および分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。この研究に使用した RBD 配列は GenBank (OP839194) で入手できます。

スループットモデリングとデバイスプログラミングに使用されるコードは、パブリック Zenodo リポジトリ (https://doi.org/10.5281/zenodo.7735167) で入手できます。

ミシガン州カーン氏、A. イクラム氏、HB ハムザ氏低・中所得国におけるワクチン製造能力。ブル。世界保健機関。 99、479–479A (2021)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

コフ、WCら。最も脆弱な人々のための新型コロナウイルス感染症ワクチンの開発と展開。科学。翻訳。医学。 13、eabd1525 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

CRウェルズ氏とAP通信ガルバーニ氏不均衡なワクチン接種率が新型コロナウイルス感染症による死亡率に及ぼす世界的な影響。ランセット感染。ディス。 22、1254–1255 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カクレ B.、ルブカイ N.、ムヒンド E.、ヤノク E.、プラザー A. ラストマイル: DRC における新型コロナウイルス感染症ワクチン (CARE International、2022)。 https://careevaluations.org/wp-content/uploads/COVID-19-vaccines-in-Democratic-Republic-of-the-Congo-April-2022.pdf

O'Shea, J.、Prausnitz, MR & Rouphael, N. SARS-CoV-2 および将来のパンデミック発生に対するワクチンへのアクセスを増やすための溶解可能なマイクロニードルパッチ。ワクチン (バーゼル) 9, 320 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Sullivan, SP、Murthy, N. & Prausnitz, MR 急速に溶解するポリマーマイクロニードルによる低侵襲性のタンパク質送達。上級メーター。 20、933–938 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サリバン、SP et al. インフルエンザワクチン接種用の溶解性ポリマーマイクロニードルパッチ。ナット。医学。 16、915–920 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim、YC、Park、JH、Prausnitz、MR 薬剤およびワクチン送達用のマイクロニードル。上級医薬品の配送。改訂 64、1547–1568 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミスティリス、MJ 他溶解性マイクロニードルパッチにおけるインフルエンザワクチンの長期安定性。医薬品の配送。翻訳。解像度 7、195–205 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gill, HS、Denson, DD、Burris, BA & Prausnitz, MR ヒト被験者の痛みに対するマイクロニードル設計の効果。クリン。 J. Pain 24、585–594 (2008)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

AM ロジャース、AS コルデイロ、RF ドネリーのテクノロジー最新情報: ワクチン送達用の溶解性マイクロニードルパッチ。医学。デバイス (Auckl)。 12、379–398 (2019)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Noh, I.、Lee, K.、Rhee, YS 核酸医薬品送達用マイクロニードルシステム。Ｊ．Ｐｈａｒｍ．調査します。 52、273–292 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

コー、KJ 他 mRNAをロードした溶解性ポリマーマイクロニードル（RNApatch）の配合、特性評価、および評価。 Sci Rep. 8、11842 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Golombek, S. et al. 皮膚における外因性タンパク質の効率的かつ迅速な生産のための中空マイクロニードルを使用した合成 mRNA の皮内送達。モル。それで。核酸。 11、382–392 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Creelman, B.、Frivold, C.、Jessup, S.、Saxon, G. & Jarrahian, C. マイクロニードルアレイパッチ業界の評価のための製造準備状況評価: 本格的な製造への障壁の調査。医薬品の配送。翻訳。解像度 12、368–375 (2021)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

モガ、KA 他拡張性と再現性の高いソフトリソグラフィーアプローチによる、迅速に溶解可能なマイクロニードルパッチ。上級メーター。 25、5060–5066 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ファクライ・ラヒジ、S. 他カプセル化されたリゾチームの活性に対する溶解マイクロニードル製造パラメーターの影響。ユーロ。Ｊ．Ｐｈａｒｍ．科学。 117、290–296 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Markarian, J. ワクチン送達用のマイクロニードルアレイパッチを製造しています。薬局。テクノロジー。 44、31–32 (2020)。

Google スカラー

ダルヴィ、M.ら。経皮薬物送達用の溶解マイクロニードルのパノラマ。生命科学。 284、119877 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Du, G. & Sun, X. 徐放性マイクロニードルの現在の進歩。薬局。フロント 2、e11–e22 (2020)。

記事 Google Scholar

チェン、W.ら。 2 型糖尿病治療用のデュアルミネラル化タンパク質/ペプチド粒子を搭載したマイクロニードルアレイパッチ。ナット。共通。 1777 年 8 日 (2017 年)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao、H.ら。ガラス状液晶ポリマー微細構造の高忠実度レプリカ成形。 ACS アプリケーションメーター。インターフェイス 8、8110 ～ 8117 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Indermun, S. et al. 経皮送達のためのマイクロニードルの製造における現在の進歩。 J.コントロール。リリース 185、130–138 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Daly, R.、Harrington, TS、Martin, GD & Hutchings, IM 医薬品向けのインクジェット印刷 - 研究と製造のレビュー。内部。Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 494、554–567 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Boehm、RD、Miller、PR、Schell、WA、Perfect、JR および Narayan、RJ 圧電インクジェット印刷を使用した、生分解性マイクロニードル上へのアムホテリシン B のインクジェット印刷。 JOM 65、525–533 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Economidou、SN et al. 皮内インスリン送達にステレオリソグラフィー (SLA) を使用して 3D プリントされたマイクロニードルパッチ。メーター。科学。工学 C Biol. 応用 102、743–755 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

コーディル、C.ら。 3D プリントされたマイクロニードルによる経皮ワクチン接種は、強力な体液性免疫と細胞性免疫を誘導します。手順国立アカデミー。科学。 USA 118、e2102595118 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elahpour、N. et al. 経皮薬物送達用の 3D プリントマイクロニードル: 20 年間の簡単なレビュー。内部。Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 597、120301 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Xu, L.、Lee, H.、Jetta, D. & Oh, KW ポリジメチルシロキサン (PDMS) のガス溶解性または透過性を利用した真空駆動の電源不要のマイクロ流体工学。ラボチップ 15、3962–3979 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヤン、Ｓ．ら。ポリマーマイクロニードルのスケーラブルな製造プロセス。内部。 J. ナノメディシン。 7、1415–1422 (2012)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nejad, HR、Sadeqi, A.、Kiaee, G. & Sonkusale, S. 低コストでクリーンルームを必要としないマイクロニードルの製造。マイクロシスト。ナノエン。 4、17073 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

福島和也ほかラットにペプチド/タンパク質薬物を経皮送達するための 2 層の溶解マイクロニードル。薬局。解像度 28、7–21 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シェーンメーカー、L.ら。 mRNA 脂質ナノ粒子 COVID-19 ワクチン: 構造と安定性。内部。Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 601、120586 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フェントン、OS 他。 siRNA および mRNA の送達のためのカスタマイズ可能な脂質ナノ粒子材料。アンジュー。化学。内部。エド。英語。 57、13582–13586 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハセット、KJ et al. mRNAワクチンの筋肉内投与のための脂質ナノ粒子の最適化。モル。それで。核酸。 15、1–11 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サブニス、S.ら。 mRNA 送達用のアミノ脂質シリーズ: 非ヒト霊長類におけるエンドソーム回避の改善と持続的な薬理と安全性。モル。それで。 26、1509–1519 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gonzalez-Gonzalez, E. et al. siRNA を使用した皮膚におけるレポーター遺伝子発現のサイレンシングと、可溶性突起アレイデバイス (PAD) によって送達されるプラスミド DNA の発現。モル。それで。 18、1667–1674 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, W.、Li, S.、Fan, X.、Prausnitz, MR は、ヒトの被験者に投与する用量を増やすためのマイクロニードルパッチの設計を行っています。 J.コントロール。リリース 339、350–360 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Davis、SP、Landis、BJ、Adams、ZH、Allen、MG、Prausnitz、MR 皮膚へのマイクロニードルの挿入: 挿入力と針破壊力の測定と予測。Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ． 37、1155–1163 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

青柳伸、和泉英、福田正. 先端角度を変えた生分解性ポリマー針と蚊の口吻の挿入機構の考察。センサーアクチュエーター A 物理学 143、20–28 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

ウォルシュ、EEら。 2 つの RNA ベースの Covid-19 ワクチン候補の安全性と免疫原性。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 383、2439–2450 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ミハイラ、R.ら。スピン遠心分離透析 (SCD) による脂質ナノ粒子の精製: siRNA と脂質の複合体を小規模で調製するための簡単でハイスループットなアプローチです。内部。Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 420、118–121 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Corbett, KS et al. SARS-CoV-2 mRNA ワクチンの設計は、プロトタイプの病原体の準備によって可能になりました。ネイチャー 586、567–571 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゲブレ、MS et al. mRNA ワクチンはマウスに迅速な抗体反応を誘導します。 NPJ ワクチン 7、88 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu、J.ら。アカゲザルにおける SARS-CoV-2 に対する DNA ワクチンの防御。サイエンス 369、806–811 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フェントン、OS 他。 B リンパ球へのメッセンジャー RNA の in vivo 送達のためのイオン化脂質材料の合成と生物学的評価。上級メーター。 29、https://doi.org/10.1002/adma.201606944 (2017)。

Zhang, H.、Leal, J.、Soto, MR、Smyth, HDC & Ghosh, D. 実験計画法による mRNA の肺送達のためのエアロゾル化可能な脂質ナノ粒子。薬学。 12、1042 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン、Ｘら。インフルエンザワクチン接種後、皮膚に高密度に充填された微小突起をドライコーティングすることにより、血清抗体のピークに達する迅速な反応速度が達成されます。 J.コントロール。リリース 158、78–84 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クアン、F.-S. 他。マイクロニードルを使用したインフルエンザウイルス様粒子の皮内ワクチン接種は、筋肉内免疫よりも優れた防御を誘導します。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 84、7760–7769 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スチュワート・ジョーンズ、GBE 他スパイク N 末端および受容体結合ドメインをコードする SARS-CoV-2 mRNA ワクチンの開発。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511319 (2022) でプレプリント。

CR ビールスら。水痘・帯状疱疹ウイルスワクチンの皮内投与と皮下投与の免疫応答と反応原性：探索的、ランダム化、部分盲検試験。ランセット感染。ディス。 16、915–922 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Levin, Y.、Kochba, E.、Hung, I.、Kenney, R. 新しいマイクロニードルデバイス MicronJet600 を使用した皮内ワクチン接種: 過去、現在、未来。ハム。ワクチン免疫療法。 11、991–997 (2015)。

記事 Google Scholar

世界保健機関。予防接種に関する専門家戦略諮問グループ会議、2012 年 4 月: 結論と勧告。奇抜なエピデミオール。記録 87、201–216 (2012)。

Google スカラー

Dey、A.ら。動物モデルにおける SARS-CoV-2 に対する DNA ワクチン候補 ZyCoV-D の免疫原性の可能性。ワクチン。 39、4108–4116 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Masinga Loembé、M. & Nkengasong、JN アフリカにおける新型コロナウイルス感染症ワクチンへのアクセス：世界的な配布、ワクチンプラットフォーム、今後の課題。イミュニティ 54、1353–1362 (2021)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Crommelin、DJA、Anchordoquy、TJ、Volkin、DB、Jiskoot、W. & Mastrobattista、E. mRNA ワクチンの安定性に関する冷酷な現実に取り組む。Ｊ．Ｐｈａｒｍ．科学。 110、997–1001 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kuwentrai, C. et al. 溶解性マイクロニードルを用いたSARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの皮内送達により、マウスの体液性および細胞性反応を誘導します。バイオエンジ。翻訳。医学。 6、e10202 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhao、P.ら。 mRNA 送達のための脂質様ナノ粒子の長期保存。バイオアクト。メーター。 5、358–363 (2020)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Ball, R.、Bajaj, P. & Whitehead, K. 脂質ナノ粒子の長期安定性の達成: pH、温度、および凍結乾燥の影響の調査。内部。 J. ナノメディシン。 12、305–315 (2016)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ランセット感染症。新型コロナウイルス感染症を皮切りに、アフリカが将来を見据える時が来ました。ランセット。感染する。ディス。 22、151 (2022)。

アフリカで作られたmRNA。ナット。バイオテクノロジー。 40、284 (2022)。

Maloy, KJ、Donachie, AM、O'Hagan, DT & Mowat, AM ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）微粒子に捕捉されたオボアルブミンによる免疫化による粘膜および全身免疫応答の誘導。免疫学 81、661–667 (1994)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、YNら。ナノ粒子のサイズは、体液性免疫のリンパ節濾胞における抗原の保持と提示に影響を与えます。ナノレット。 19、7226–7235 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

Meso Scale Discovery の寛大なアドバイス、援助、試薬に感謝します。コッホ研究所のロバート A. スワンソン (1969) バイオテクノロジーセンター (RRID: SCR_018674) の技術サポート、具体的には組織学コア、ナノテクノロジー材料コア、バイオマイクロセンター、動物イメージングおよび前臨床試験施設に感謝します。 MIT 材料科学工学部の工学材料研究所の技術サポートに感謝します。この研究は、国立がん研究所からの Koch Institute Support (core) Grant P30-CA14051 によって部分的に支援されました。この研究は、生物医学先端研究開発局 (BARDA) 助成金 DHHS/OS/ASPR/BARDA/DRIVe EZ-BAA-18-100-SOL-00018 によっても支援されました。 AVS はフェローシップの受賞者であり、ベルギー系アメリカ人教育財団 (BAEF) とワロン地域ブリュッセル国際優秀奨学金 (WBI.World) に感謝いたします。 MK はフェローシップの受賞者であり、ボドサキ財団とオナシス財団に感謝の意を表します。私たちは、国立衛生研究所 (T32 AI0073787) からの LHT への支援に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Aurélien vander Straeten、Morteza Sarmadi、John L. Daristotle。

デビッド H. コッホ統合癌研究所、マサチューセッツ工科大学、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

オーレリアン・ヴァンダー・ストラーテン、モルテザ・サルマディ、ジョン・L・ダリストトル、マリア・カネリ、ジョー・コリンズ、アプルヴァ・パルデシ、ジョーリ・ハン、ドゥルヴ・ヴァルシュニー、ベナズ・エシャギ、ジョニー・ガルシア、ティモシー・A・フォースター、ゲイリー・リー、ナンディタ・メノン、シャハド・K・アルサイアリ、ロバートランガー＆アナ・ヤクレネック

ウイルス学およびワクチン研究センター、ベス・イスラエル・ディーコネス・メディカルセンター、ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州、米国

リサ・H・トスタノスキー、キャサリン・ジェイコブ＝ドーラン、オリヴィア・C・パワーズ、ケビン・ホール、ダン・H・バロウシュ

マサチューセッツ工科大学化学工学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

シドニー・L・ピョン、張林子軒、ロバート・ランガー

ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州、米国

キャサリン・ジェイコブ・ドラン & ダン・H・バルーフ

MGH、MIT、およびハーバード大学のラゴン研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

キャサリン・ジェイコブ・ドラン & ダン・H・バルーフ

チューリッヒ工科大学、機械プロセス工学部、高分子工学研究所、チューリッヒ、スイス

モリス・ウルフ & マーク・W・ティビット

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概念化: AVS、MS、JD、MK、JC、AJ、RF 方法論: AVS、MS、JD、MK、LT、JC、AP、DV、BE、JG、TF、GL、NM、CJD、SL、LZ、OP 、KH、SA、MW 調査: AVS、MS、JD、MK、LT、JC、AP、DV、BE、JG、TF、GL、NM、SP、CJD、SL、LZ、OP、KH、MW 可視化: AVS 、MS、JD、JH 資金獲得: AJ、RL、AVS、MK プロジェクト管理: AVS、JD、JC、AJ 監督: AJ、RL、DB、MT 執筆—原案: AVS、MS および JD 執筆—レビューおよび編集: AVS、MS、JD、LT、JH、RF、DB、RL、AJ

ロバート・ランガーまたはアナ・ヤクレネックへの通信。

補償の有無にかかわらず、RL が関与しているエンティティのリストについては、www.dropbox.com/s/yc3xqb5s8s94v7x/Rev Langer COI.pdf?dl=0 を参照してください。補償の有無にかかわらず、AJ が関与しているエンティティのリストについては、https://www.dropbox.com/s/wre16lh7jr7bvoi/230410%20Jaklenec%20COI.pdf?dl=0 を参照してください。 AVS、MS、JD、MK、JC、RL、および AJ は、記載された技術に関連する係属中の特許出願 (17/903586) の発明者として指名されています。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Biotechnology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

独立コンサルタント: ロバート・ファラ。

(a) PDMS 空気透過性に基づいて負のマイクロニードル型に装填し、その後ポリマー溶液を乾燥させます。 PDMS シートの下に真空を適用し、空気透過性の PDMS 型を通してワクチンインクの下から空気を除去します。金型の上にも真空を適用することで乾燥が促進されます。 (b) PDMS の空気溶解度に基づいて負のマイクロニードル型に装填し、その後ポリマー溶液を乾燥させます。 (c) PDMS モールドの底部に真空を適用するための真空装置の構成。 (d) 異なるポリマー対架橋剤比から作られた PDMS のポリマー溶液ローディング時間 (n = 3 個の独立したサンプル)。通常の一元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定) を使用しました。（ e ）さまざまな真空値で脱気され、ポリマー溶液が充填されたPDMS金型からのMNPの画像。（ f ）5〜10分または1時間後にポリマー溶液を脱気したPDMSモールドに追加したMNPの画像。 (g – h) ポリマー溶液を分注した後の針の高さの経時的変化 (n = 13 ～ 18 の個々の針)。（i – j）さまざまな脱気条件後の画像からの正規化された針の高さ（n = 10〜18の個々の針）。 (k) この研究で使用したさまざまなポリマー溶液について測定した粘度 (n = 1)。データは平均±標準偏差を表します。 P 値は次のように表されます。 *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。 MPa、メガパスカル。 NS、重要ではありません。

(a) さまざまな容量の 20% w/w PVP:PVA 溶液から作成した MNP の画像。極薄の裏地でワクチンの無駄を最小限に抑えます。２０％ｗ／ｗＰＶＰ：ＰＶＡ溶液はクリスタルバイオレットで着色された。 (b–c) さまざまな MNP マトリックス配合から得られた、塗布量の最適化画像と乾燥バッキングの真円度測定 (n = 1)。

(a) 積載ステーションを形成するために一緒に切断および取り付けられたアクリル片の CAD 設計。 (b) ローディングステーション、(c) 乾燥ステーションのヘッドカバー、(d) 5×5 MNP ポジティブ、(e) ネガティブ MNP モールドの 5×5 PDMS シートの写真。 (f) 注釈が付けられた機能を備えた MVP システムの写真。 (g) 分注システムと分注高さを示す概略図。分注パラメータの流量 (h)、ろ過 (i)、ニードルサイズ (j)、および分注高さ (k) が結果の液滴サイズに及ぼす影響。特に明記しない限り、すべての差は (P < 0.01) で有意です。通常の一元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定) を使用しました (グループあたり n = 3 MNP)。 (l) 印刷トレイ上に塗布および乾燥させた 100 個の MNP の画像。データは平均 ± SD *P ≤ 0.05 を表します。 **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。 NS、重要ではありません。

(a) (a) 1 ステップローディングおよび (b) 2 ステップチップローディングに使用されるプロセスの概略図。ワクチンとポリマーを含む溶液は、まずロボットアームを使用して PDMS 型の上に分配されます。同時に、マイナス 1 バールの真空が適用され、溶液がネガ型に充填されます。次に、溶液を乾燥剤雰囲気と -0.6 bar の真空下で乾燥させます。ワンステップローディング (a) の場合、ワクチンとチップとバッキングを形成するのに十分なポリマーがワンステップで堆積されます。 2 段階のチップローディング (b) では、最初にワクチンとポリマーをチップのみに堆積させ、次にポリマーのみを使用して同じ手順を繰り返して MNP の裏打ちを形成します。 (c) 自動 MVP によって製造された、正しく形成された全長の鋭利なマイクロニードルの特性 (生産された針全体のパーセンテージとして) (n = 30 パッチ)。製造された MNP には、パッチあたり平均 37 ± 8 個の針がありました。 (d) 塗布スループットは塗布された液滴の高さとパッチサイズの関数であり、(e) 乾燥スループットは乾燥時間とパッチあたりの針の数の関数です。どちらのスループットも、(f) 乾燥時間と (g) パッチサイズの関数です。スループットが最も低いステップによって、マイクロニードルワクチンプリンターの全体的なスループットが決まります。

(a) 自動化された MNP 製造のスループットは、MNP 金型のトレイをモジュール式に乾燥ラックに移動してワクチンの乾燥ステップを促進することによって増加できます。マイクロニードルモールドを充填するためのバキュームスルー塗布は、モールド搬送装置 (中央) またはトレイラック (右) のいずれかで行うことができます。 (b) 乾燥スループットは、垂直乾燥ラック内のトレイの長さとトレイの数の関数として表示されます。乾燥ラックのサイズ (h) は、単一トレイの高さ 50 mm を想定して推定されました。シングルトレイ装置と同様に、乾燥時間は 48 時間と想定されます。 (c) PDMS 型は、MNP 製造プロセスを迅速化するために、ワクチンの分注前に陰圧を使用した脱気技術で前処理できます。脱気された PDMS 型を使用すると、ロボットアームがワクチン溶液を連続的に分注できます。完全に分注された PDMS モールドは、コンベアベルトを使用して乾燥ラックに移動できます。このプロセス全体は、処理中の無菌性を維持するために無菌筐体内に収められます。 (d–i) 自動パッチ脱型用の設計。 (d) ワクチンのマイクロニードルパッチが PDMS 型内で完全に乾燥した後、(e) ロボットアームが両面テープの付いたアクリルの裏地を運びます。 (f) ロボットアームを位置合わせし、アクリル接着剤の裏地をマイクロニードルパッチに貼り付けます。(g)、ロボットアームが垂直に持ち上げられると、MNP が PDMS モールドから取り出されます。 (h) MNP 取り外し用に設計された金属スリットの間にロボットアームの先端が入ります。ロボットアームが垂直に上昇すると、MNP はロボットアームの先端から外れてパッケージ内に落ちます (i)。MNP は針の先端との直接接触を防ぐためにホバリングしています。型から取り出された MNP はパッケージ化され、使用するまで無菌の乾燥した環境に保管されます。

分注に使用されるタンパク質質量の関数として、1 ステップまたは 2 ステップの製造プロセスを使用したチップローディング効率 (a) とチップローディング効率 (b) の比較。 (c) 2 段階製造プロセスの最初の段階でタンパク質 (BSA) とともに使用されたポリマー (PVP:PVA) の質量の比較。 100 μg および 200 μg BSA に対して、低ポリマー質量は 0.8 mg PVP:PVA ですが、高ポリマー質量はそれぞれ 4 mg および 8 mg PVP:PVA です。通常の二元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定) を使用しました (n = 6 個の独立したサンプル)。 (d) MNP の 3 つの異なる大きなバッチにロードされたウシ血清アルブミン (BSA) の相対質量。平均に正規化されています。バートレット検定 (p = 0.006) により、標準偏差が大幅に異なる可能性があることが明らかになり、グループ間の両側 t 検定により、30 mm で塗布されたパッチの標準偏差は他の 2 つのグループとは大きく異なり、標準偏差は同等であったことが明らかになりました。相互に（手作りの場合は n = 50 パッチ、研究されたいずれかの塗布高さについては n = 40 パッチ）。（ e ）MVPを使用して製造されたn = 100のMNPに対する10μgのDNAワクチンのパッチあたりのローディング効率。データは平均±標準偏差を表します。 P 値は次のように表されます。 *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。 NS、重要ではありません。

(a) mRNA カプセル化濃度、(b) mRNA カプセル化効率、および (c) 2 つの異なるイオン化可能脂質 (cKK-e12 または Lipid 5) で作成され、fLuc または RBD をコードする mRNA をカプセル化した LNP の直径 (n = 3)。（ d ）cKK-e12で作成したLNPにカプセル化された0.6 mgの製剤および50 ngのmRNAの存在下で測定されたHeLa細胞の生存率（n = 4の技術的複製）。（ e ）ポリビニルアルコール（PVA）またはポリビニルピロリドン（PVP10またはPVP60、それぞれ分子量10 kDaまたは60 kDa）を使用して、さまざまなポリマー配合物で作られたMNPの合計乾燥時間。 2 つの異なる乾燥アプローチを研究しました。真空にする前に窒素流下で 10 時間乾燥するか、真空にする前に乾燥剤を使用して 24 時間乾燥する (n = 1)。 100% PVP パッチは脆すぎるため、破損することなく型から取り出すことができませんでした。 (f) さまざまなポリマーから作られた mRNA-LNP をロードした MNP の圧縮試験で測定された剛性および (g) ピーク力。通常の一元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定) を使用しました (グループあたり n = 5)。（ h ）合成直後、濃縮後、ワクチンインクへの配合後、および乾燥してMNPマトリックスを形成した後に、動的光散乱（dls）によって測定されたmrna-lnp直径。 (グループあたり n = 3)。（i）合成後のmRNA-LNP、（j）ワクチンインク中のmRNA-LNP、および（k）マイクロニードルパッチ中のmRNA-LNPの代表的な透過型電子顕微鏡（TEM）およびクライオTEM画像。（l）キャピラリー電気泳動を使用して特徴付けられた、FLuc mRNA-LNP、ワクチンインクからのmRNA、およびMNPからのmRNAからのmRNAフラグメント分析。 (m) 1 つのマイクロニードルパッチの針内のカプセル化された mRNA の分布。 (n) 針ごとのカプセル化された mRNA 負荷のヒストグラム。 (o) カプセル化された mRNA のローディングおよび (p) パッチあたりのローディング効率 (n = 2 の独立したサンプル)。（q）LNP（6つの技術的複製）またはマイクロニードルパッチから再溶解した同じLNPによるHeLaトランスフェクション後のタンパク質発現（n = 2の独立したサンプル、MNPあたり6つの技術的複製）。データは平均値±標準偏差を表す

(a) ピラミッドまたは円錐形のマイクロニードルパッチで使用される個々のマイクロニードルの寸法。隣接する 2 本の針の間隔 (ピッチ) は 1000 μm です。 (b) ピラミッド型および円錐型の MNP について、エクスビボでブタの皮膚に適用したときの針の溶解の時間の関数としての代表的な光学イメージング。 (c – e) PVP:PVA 2:1 と 1:1 から作られた円錐形と角錐形のマイクロニードルの、ex vivo 豚皮膚における溶解体積の比較。対応のない両側 t 検定 (グループあたり n = 23 ～ 59 針)。データは平均±標準偏差を表します。 P 値は次のように表されます。 *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001。 NS、重要ではありません。

(a) この論文で使用した mRNA 構築物の SARS-CoV-2 RBD 配列の概略図。シグナル配列 (SS) はオレンジ色、RBD ドメインは青色、T4 三量体モチーフは緑色です。 (bc) fLuc をコードする mRNA を封入した LNP をさまざまな水溶性ポリマーと混合し、乾燥させました。 LNP は、ポリマーマトリックスと混合する前に、PBS または DI 水中で透析されました。 HeLa 細胞におけるタンパク質発現は、再溶解ポリマーによるトランスフェクション後に測定され、懸濁液中の LNP に匹敵するタンパク質発現を生成するポリマーの組み合わせをスクリーニングしました (n = 4 技術的反復)。 (dE) 液滴サイズは、高いワクチン充填効率にとって重要です。マランゴニ効果により、大きな液滴サイズ (d) は、モールドの中心に分配される小さな液滴 (e) よりも充填効率が低くなります。（ f ）脂質 5 で作成され、RBD をコードする mRNA を封入した LNP 懸濁液でトランスフェクトされた HEK 細胞。 RBDをコードするmRNAをカプセル化するLNPをMNPから溶解し、MNPにロードした後に生物活性を示すために添加しました。 RBD は緑色 (Alexa Fluor 488 を二次抗体として使用)、アクチンは赤色 (ローダミンファロイジン)、核は青色 (DAPI) で示されます。（ g ）MNPチップローディング（ h ）および in vivo 研究に使用されたさまざまなmRNA-LNPコンストラクトのローディング効率（ n = 3の独立したサンプル）。インビボ研究のために、4 つの MNP をパッチあたり 1.5 μg で投与し、理論的な用量は 6 μg となりました。 (i) MNP 作製に使用した 6 μg mRNA のうち、MNP のさまざまな領域で回収された mRNA のパーセントを評価しました。約 25% がマイクロニードルで見つかり、ローディング効率の測定と一致し、残りの mRNA がバッキングで見つかりました。報告された合計は針とバッキングの合計であり、すべての mRNA が MNP に含まれていることを示しています (n = 5 つの独立したサンプル)。データは平均値±標準偏差を表す

(a) C57BL/6 マウスの in vivo 実験のための免疫レジメン。 (b) 発光によって測定した FLuc mRNA 発現の動態。 mRNA-LNP 中の 1 μg の mRNA を、筋肉内 (IM) 注射またはマイクロニードルパッチ (MNP) 適用のいずれかによって C57BL/6 マウスに投与しました (n = 5 生物学的に独立したサンプル)。 MNP では、mRNA-LNP の懸濁液に比べて、mRNA 発現のピークが遅くなります。 (c) PVP:PVA 1:1 MNP mRNA-LNP 中で 37 °C で 1 か月間保存した後の FLuc 発現。通常の二元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定) を使用しました (n = 5 生物学的に独立したサンプル)。（ d ）SARS-CoV-2 Sタンパク質受容体結合ドメインの結合応答の強度を測定する電気化学発光アッセイを使用して、1か月（1 mo）または3か月（3 mo）保存したマイクロニードルパッチの免疫原性。すべての BALB/c マウスは、筋肉内注射 (IM) により 10 μg 用量の SARS-CoV-2 RBD mRNA で初回刺激されました。４週目に、比較のために追加免疫を受けなかった群を除いて、保存時間および状態に応じて異なる追加免疫用量を適用した。血清を 3 週間 (追加免疫前) および 9 週間 (追加免疫後) に収集しました (n = 5 生物学的に独立したサンプル)。データは平均±標準偏差 NS を表し、有意ではありません。

補足注記 1 ～ 4 および補足表 1。

映画S1。

映画S2。

映画S3。

映画S4。

映画S5。

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転載と許可

vander Straeten, A.、Sarmadi, M.、Daristotle, JL 他熱安定性の新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) mRNA ワクチン用のマイクロニードルワクチンプリンター。ナットバイオテクノロジー (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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受信日: 2022 年 1 月 10 日

受理日: 2023 年 3 月 30 日

公開日: 2023 年 4 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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